T-2毒素降解菌株的筛选、鉴定与降解机制分析

马 妍，孙长坡，王 峻，杜 稳，刘虎军，周文化，赵一凡,*

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

T-2毒素是由拟枝孢镰刀菌、枝孢镰刀菌、三线镰刀菌等真菌产生的有毒次生代谢物[1]，属于毒性最强的A类单端孢霉烯族毒素，主要污染燕麦、小麦、大麦、玉米等谷物和动物饲料[2]，随之进入食物链对人畜的健康造成巨大危害。T-2毒素具有肝脏、消化、神经、免疫和生殖毒性，可引起动物和人体肝细胞水肿、胃肠道溃疡、脑膜出血、淋巴细胞坏死、妊娠率降低等症状[3-5]。由于T-2毒素的高毒性和污染广泛性，如何控制与消除T-2毒素的危害受到学者们越来越多的关注。

目前，T-2毒素的脱毒方法主要有物理、化学和生物法，前两者均能有效去除毒素，但存在损害营养物质，引入新杂质带来二次污染的局限性[6-7]；生物法包括利用微生物产酶（或代谢物）降解毒素和吸附毒素两种方式，具有绿色、安全、专一、高效等优点，是近年来真菌毒素脱毒研究的热点。微生物吸附具有可逆性会导致毒素分子重新释放，限制其实际应用；微生物产生的酶可将毒素降解为其他低毒或无毒的产物，应用前景广阔，因此国内外学者对T-2毒素降解微生物展开了广泛研究。向雨珂[8]从土壤中利用96 孔板高通量筛选出6 株T-2毒素脱毒菌株，通过质谱对其中1 株氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）的代谢产物进行了分析与推导；吴娱[9]以苯基环氧乙烷为底物筛选到1 株黑曲霉（Aspergillus niger），通过小鼠实验证明了该菌株分泌的胞外酶能将T-2毒素降解为毒性较低的物质；Fuchs[10]和Gao Xiaojuan[11]等从瘤胃液中分离的真杆菌（Eubacteriumsp.）BBSH797使T-2毒素部分降解为HT-2，并且能将T-2毒素的代谢产物（HT-2、T-2三醇、T-2四醇等）转化为其脱环氧形式，该菌株是目前唯一一株被批量生产的脱毒菌剂。现有研究主要集中于T-2毒素降解微生物的筛选、降解效果的表征以及降解产物的推导上，对降解机制的分析还有所欠缺，且菌株降解性能不稳定、易退化等问题限制了大规模应用，生物降解T-2毒素的菌种资源仍然较为匮乏。

本研究从小麦样品中分离筛选对T-2毒素具有降解性能的微生物，并进行菌种鉴定与降解特性研究，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）仪分析2 株菌单独和共同降解T-2毒素产生的代谢产物，从而分析其降解机制，以期降低谷物中T-2毒素的含量，为保障粮油食品和饲料质量安全奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦样品来源于安徽淮北、安庆等地区（2020年）。

甲醇、乙腈（均为色谱级）美国Thermo Fisher公司；T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、新茄镰孢菌醇（neosolaniol，NEO）标准品 北京Pribolab科技有限公司。

LB肉汤培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，固体培养基加20 g/L琼脂；基础盐培养基（minimal salt medium，MSM）：硫酸铵0.5 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钠2.44 g/L，磷酸二氢钾1.52 g/L，最后加氯化钙0.05 g/L，pH 6.8；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：氯化钠8 g/L，氯化钾0.2 g/L，十二水磷酸二氢钠3.63 g/L，磷酸二氢钾0.24 g/L，pH 7.4。

1.2 仪器与设备

Evolution 300紫外-可见分光光度计 美国Thermo Fisher公司；e2695型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、2475型荧光检测器、XBridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美国Waters公司；UPLC-Q-TOF-MS仪 美国Agilent公司；VCX-130超声波破碎仪 美国Sonics公司；真空离心浓缩仪 美国Labconco公司；C1000 Touch聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 T-2毒素脱毒菌株筛选

初筛：取10 g小麦样品与20 mL生理盐水混匀，静置后取上清液50 μL与MSM（含3 μg/mL T-2毒素）于37 ℃、200 r/min条件下培养7 d，HPLC检测T-2毒素残留量；具有降解效果的样品梯度稀释后涂布到LB固体培养基上，连续划线纯化至长出单菌落；挑取单菌落接种于MSM（含3 μg/mL T-2毒素），37 ℃、200 r/min条件下培养 5～7 d，HPLC检测T-2毒素残留量，脱除率大于90%的样品进行复筛。

复筛：将初筛菌株单菌落接种于LB液体培养基，于37 ℃、200 r/min条件下培养12～24 h，收集菌液于5 000 r/min离心5 min，菌体用MSM培养基洗涤2 次后重悬，菌悬液接种于MSM中（含3 μg/mL T-2毒素），37 ℃、200 r/min振荡培养5～7 d，HPLC检测T-2毒素残留量。重复进行多次复筛，以验证菌株对T-2毒素脱除效果的稳定性。

1.3.2 T-2毒素脱毒菌株鉴定

形态鉴定：将获得的菌株划线于LB固体平板上，37 ℃恒温培养12～48 h，观察菌落形态；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养24 h，取适量菌液用草酸铵结晶紫溶液染色，在光学显微镜下观察菌体特征。

分子鉴定：挑取少量单菌落作为16 SrDNA扩增的PCR 模板。引物采用细菌通用引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR扩增体系（25 μL）：上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶12.5 μL，无菌水11 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性10 min；95 ℃变性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，16S rDNA基因序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据比对进行同源性分析，采用MEGA7.0软件中的Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.3.3 脱毒曲线测定

参考Zhai Yaoyao等[12]的方法并适当修改。挑取单菌落接种于LB液体培养基进行发酵培养，收集发酵菌液于5 000 r/min离心5 min，菌体用PBS洗涤2 次后重悬，以初始OD600nm值0.1接种于LB液体培养基中（一组含5 μg/mL T-2毒素，一组无T-2毒素），于37 ℃、200 r/min条件下振荡培养。每间隔2 h取样，测定其OD600nm值并用HPLC检测T-2毒素残留量。

1.3.4 吸附作用分析与降解活性物质定位

参考Chen Yong等[13]的方法。收集两份发酵菌液，一份直接于5 000 r/min离心5 min，另一份121 ℃高压灭活20 min后再离心，两组菌体均用新的LB液体培养基重悬，菌悬液分别与5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min条件下共培养，含T-2毒素的LB液体培养基作为空白对照，HPLC检测T-2毒素残留量。

上述活细胞组将T-2毒素完全消除的时间点，收集剩余反应体系于5 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm无菌滤膜即为胞外上清液；菌体用等体积PBS洗涤2 次后重悬，菌悬液通过超声破碎仪进行细胞破碎，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm无菌滤膜为细胞内容物；将它们分别与5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min条件下培养2 h，含T-2毒素的PBS作为空白对照，HPLC检测T-2毒素残留量。

1.3.5 灭活与抑制剂对细胞内容物降解T-2毒素的影响

参考Zhang Jing等[14]的方法。将上述获得的细胞内容物作如下处理：1）与1 mg/mL蛋白酶K、1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）于55 ℃金属浴中反应1 h；2）与1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）于37 ℃金属浴中反应1 h；3）121 ℃高压灭活30 min。取上述反应液分别与5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min条件下培养2 h，含T-2毒素的PBS作为空白对照，HPLC检测T-2毒素残留量。

1.3.6 菌株AFJ-2和AFJ-3降解T-2毒素产物分析

粗酶液制备：收集发酵菌液于5 000 r/min离心5 min，菌体用PBS洗涤2 次后重悬，超声波破碎仪对菌悬液进行破碎，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，上清液过0.22 μm无菌滤膜得到胞内粗酶液。

酶反应：1）AFJ-2和AFJ-3粗酶液分别与T-2毒素共培养；2）AFJ-2和AFJ-3粗酶液1∶1混匀后再与T-2毒素共培养；3）AFJ-2（AFJ-3）粗酶液先与T-2毒素共培养，在T-2毒素完全降解的时间点加入AFJ-3（AFJ-2）粗酶液，同时以加入等体积PBS作为对照。上述反应均以不加酶液含T-2毒素的PBS作为空白对照，T-2毒素终质量浓度为10 μg/mL，37 ℃、200 r/min条件下振荡培养，不同时间取样，质谱检测T-2毒素含量与产物生成。

1.3.7 T-2毒素检测

1.3.7.1 HPLC

参照GB 5009.118—2016《食品中T-2毒素的测定》。样品前处理：待测样品于12 000 r/min离心10 min，取100 μL上清液，当培养基为MSM或PBS时，加入等体积甲醇混匀，取出100 μL于真空离心浓缩仪中蒸干，衍生，HPLC检测；当培养基为LB时，加入等体积乙酸乙酯混匀，7 000 r/min离心5 min收集上清液，重复萃取3 次，合并上清液，于真空离心浓缩仪中蒸干，衍生，HPLC检测。

T-2毒素标准曲线：以T-2毒素质量浓度（1～5 μg/mL）为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到一元回归线性方程y=5×106x－120 373，R2=0.999 2，T-2毒素质量浓度与峰面积的线性关系良好。T-2毒素降解率计算公式如下：

1.3.7.2 UPLC-Q-TOF-MS

色谱条件：色谱柱为Agilent Poreshell 120 EC-C18柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵，流动相B为甲醇-0.1%甲酸；流动相梯度洗脱程序：0～1 min，0%～90% A、100%～10% B；1～1.5 min，90%～55% A、10%～45% B；1.5～8.5 min，55%～0% A、45%～100% B；8.5～9.5 min，维持0% A、100% B；9.5～10 min，0%～90% A、100%～10% B。流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；上样量3 μL；Post Run 2 min。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描；雾化气压力40 psi；干燥气流速5 L/min；干燥气温度300 ℃；锥孔电压65 V；碎裂电压175 V；帽电压4 000 V；质量扫描范围m/z100～1 200（MS）、30～1 000（MS/MS）；采集速率2 spectra/s（MS）、3 spectra/s（MS/MS）；碰撞能量范围10～40 eV。

样品前处理：取待测样品（12 000 r/min离心10 min上清液）100 μL加等体积甲醇混匀，质谱检测。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 T-2毒素脱毒菌株筛选

从50 份小麦样品中筛选出30 份对T-2毒素具有脱毒效果的样品，分离纯化得到48 种单菌落，其中10 株菌对T-2毒素的脱除率大于90%，对其进行多轮复筛后，获得2 株脱毒效率高且稳定的菌株AFJ-2和AFJ-3，复筛结果如表1所示。

表1 T-2毒素脱毒菌株复筛结果Table 1 Secondary screening results of T-2 toxin-degrading strains

2.2 T-2毒素脱毒菌株鉴定

菌株AFJ-2和AFJ-3经16S rDNA初步鉴为短小杆菌属（Curtobacteriumsp.）和芽孢杆菌属（Bacillussp.）菌株。菌株AFJ-2在LB上呈较小的黄色圆形，菌落不透明，边缘不整齐，显微镜下呈现短杆状，单个或成对排列；菌株AFJ-3在LB上呈光滑的乳白色圆形，形状较大，菌落不透明，边缘光滑，显微镜下呈现粗大杆状，单个或短链排列。AFJ-2和AFJ-3的形态学和系统发育特征如图1所示。

图1 菌株AFJ-2和AFJ-3的形态学和系统发育特征Fig.1 Morphological and phylogenetic characteristics of strains AFJ-2 and AFJ-3

2.3 菌株AFJ-2和AFJ-3对T-2毒素的降解特性

2.3.1 脱毒曲线

以初始OD600nm=0.1将菌株AFJ-2和AFJ-3接种至含（无）T-2毒素的LB培养基中，观察2 株菌的生长状况、T-2毒素的脱毒过程以及T-2毒素对菌株生长的抑制效果。如图2所示，菌株AFJ-2和AFJ-3分别在2～12 h和6～14 h内呈对数生长，T-2毒素质量浓度随着菌体密度快速增加而迅速减少，分别在7 h和12 h将5 μg/mL T-2毒素完全消耗，因此2 株菌对T-2毒素的脱除效率较高，而在12 h和14 h菌株生长才进入稳定期，说明菌株优先利用T-2毒素作为碳源以供生长需要。AFJ-2的生长未受T-2毒素毒性作用的影响，但AFJ-3的生长受到明显抑制，故其脱毒效率低于AFJ-2。T-2毒素可通过抑制微生物细胞蛋白质、RNA和DNA的合成，从而影响菌体生长繁殖[15]。

图2 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）脱毒曲线Fig.2 Time courses of T-2 toxin degradation by strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.2 菌株AFJ-2和AFJ-3对T-2毒素的吸附作用

将2 株菌菌体的活细胞与灭活细胞与T-2毒素共培养，观察其对T-2毒素的降解与吸附能力。由图3可知，当菌株AFJ-2和AFJ-3的活细胞与T-2毒素反应时，T-2毒素质量浓度随着培养时间延长逐渐降低，分别在2 h和12 h内将T-2毒素从5 μg/mL降至0.16 μg/mL和0.11 μg/mL，而灭活细胞对T-2毒素不产生任何作用。因此2 株菌对T-2毒素的脱除均属于生物降解，且不存在吸附作用。

图3 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）对T-2毒素的吸附Fig.3 Adsorption efficiency of T-2 toxin by strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.3 T-2毒素降解活性物质定位

为了进一步确定2 株菌降解T-2毒素的活性物质位于胞内或胞外，将胞外上清液和细胞内容物与T-2毒素反应2 h后检测T-2毒素含量，结果如图4所示，菌株AFJ-2和AFJ-3的胞外上清液对T-2毒素几乎不降解，而细胞内容物在2 h内分别使T-2毒素质量浓度从5 μg/mL减少至0.24 μg/mL和1.16 μg/mL，反应效率极高。因此，2 株菌降解T-2毒素的活性物质均位于胞内，并且很可能是一种或多种酶。

图4 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）降解活性物质定位Fig.4 Localization of T-2 toxin-degrading substance in strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.4 灭活与抑制剂对细胞内容物降解T-2毒素的影响

灭活、蛋白酶K、SDS和PMSF均能破坏蛋白质的结构使酶变性失活，通过上述处理后的细胞内容物与T-2毒素反应2 h后，测定其含量并计算降解率，结果如图5所示，2 株菌的细胞内容物对T-2毒素的降解均受到显著抑制（P＜0.05），由此证明的确是酶发挥了作用，且PMSF的显著抑制效果说明T-2毒素降解酶系统中含有丝氨酸基团[16]。而EDTA仅表现出轻微抑制效果，可能是浓度偏低或反应时间较短的原因，已有研究[17-19]使用的EDTA浓度均超过10 mmol/L，向雨珂等[20]使用1 mmol/L EDTA处理胞外上清液，需反应24 h才观察到上清液对T-2毒素降解的抑制作用。

图5 灭活与抑制剂对AFJ-2（A）和AFJ-3（B）细胞内容物降解T-2毒素的影响Fig.5 Effect of inactivators and inhibitors on the degradation of T-2 toxin by cellular contents of AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.4 T-2毒素降解产物分析

2.4.1 菌株AFJ-2降解T-2毒素产物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-2降解T-2毒素的产物，总离子流图如图6A～D所示，T-2毒素（保留时间（retention time，tr）=7.1 min）随时间递增而减少，4 h即被完全降解，未知峰a（tr=6.5 min）先大量增加后略微减少，未知峰b（tr=5.8 min）在反应后期缓慢增加，因此二者均为T-2毒素转化的产物。

图6 菌株AFJ-2降解T-2毒素产物分析Fig.6 Analysis of degradation products of T-2 toxin by strain AFJ-2

利用软件Mass Hunter搜索所有可能化合物，与软件PCDL中T-2毒素常见代谢产物数据库进行比对。产物a、b的匹配结果为HT-2（C22H32O8）、T-2三醇（C20H30O7），m/z分别为447.204 4[＋Na]、405.189 0[＋Na]，与T-2毒素（489.215 1[＋Na]）依次相差42，等于一个乙酰基[—COCH3]的相对分子质量，且化学结构与T-2毒素依次在C-4和C-15位相差一个乙酰基团。

采用40 eV的碰撞能量，对产物a、b与HT-2、T-2三醇标准品溶液进行二级质谱分析，结果如图6E～H所示，二级质谱图中tr、碎片离子的分布和相对丰度三者基本吻合，可以确定产物a、b分别是HT-2、T-2三醇。

2.4.2 菌株AFJ-3降解T-2毒素产物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-3降解T-2毒素的产物，如图7A～D所示，T-2毒素（tr=7.0 min）在12 h被完全降解，而此时观察到未知峰c（tr=4.0 min）大量增加。通过软件Mass Hunter和PCDL分析，产物c的匹配结果为NEO（C19H26O8），m/z为405.152 8[＋Na]，与T-2毒素相差84，等于一个异戊酰基[—CH3CCH3CH2CO]的相对分子质量，化学结构与T-2毒素在C-8位相差一个异戊酰基。通过对产物c和NEO标准品溶液的二级质谱图分析，可以确定产物c是NEO，结果见图7E、F。

图7 菌株AFJ-3降解T-2毒素产物分析Fig.7 Analysis of degradation products of T-2 toxin by strain AFJ-2

2.4.3 菌株AFJ-2和AFJ-3共同降解T-2毒素产物分析

菌株AFJ-2和AFJ-3粗酶液混合后与T-2毒素反应，利用Mass Hunter分析产物变化规律，通过m/z提取总离子流图中各产物峰并积分可获得其峰面积，用来代表降解产物的相对含量，结果如图8A所示。2 株菌单独作用的产物HT-2、T-2三醇和NEO都存在，单独作用下HT-2和NEO大量生成后维持不变（数据未显示），而共同作用时它们大量生成后均存在下降趋势。同时，发现新的产物X随时间延长大量增加，因此产物X可能是HT-2和NEO继续发生转化生成的产物。通过软件分析产物X匹配结果为4-脱乙酰-NEO或8-乙酰-T-2四醇或15-脱乙酰-NEO，3 种物质为同分异构体，仅侧链烷基的位置不同。

图8 菌株AFJ-2和AFJ-3共同降解T-2毒素产物分析Fig.8 Analysis of co-degradation products of T-2 toxin by strains AJ-2 and AFJ-3

通过不同时间先后加入AFJ-2和AFJ-3粗酶液分析产物X。如图8B所示，在AFJ-2将T-2毒素完全降解的时间点（图中虚线处）加入AFJ-3的粗酶液，HT-2开始呈现下降趋势，也出现了产物X随时间缓慢大量增加，因此认为产物X是HT-2减少转化的产物。同理可得，如图8C所示，AFJ-3将T-2毒素完全降解时加入AFJ-2粗酶液，NEO开始减少，产物X缓慢大量增加，因此产物X也是NEO减少转化的产物。

根据上述实验结果推断，如图9所示，AFJ-2能够以AFJ-3降解T-2毒素产生的NEO为底物，使其脱去C-4乙酰基变成产物X；AFJ-3能够以AFJ-2降解T-2毒素产生的HT-2为底物，使其脱去C-8异戊酰基变成产物X；结合降解位点和化学结构推测产物X为4-脱乙酰-NEO。据文献报道，HT-2、T-2三醇和NEO的毒性均低于T-2毒素，毒性大小依次为T-2＞HT-2＞T-2三醇＞NEO[21-23]。至今未有4-脱乙酰-NEO毒性作用的详细报道，根据其烷基侧链仅剩一个乙酰基团推测，4-脱乙酰-NEO的毒性低于上述3 种产物。

图9 菌株AFJ-2和AFJ-3对T-2毒素的降解机制Fig.9 Degradation mechanism of T-2 toxin by strains AFJ-2 and AFJ-3

3 讨论与结论

作为毒性最强的单端孢霉烯族毒素、T-2毒素可导致亚致死性或致死性中毒，严重威胁人类和动物的生命健康。相较于传统的物理、化学脱毒法，生物法具有高效、专一、安全的特点，筛选降解微生物是控制T-2毒素污染的一项有效措施。早在20世纪80年代，Ueno等[24]从土壤中发现了短小杆菌114-2能将T-2毒素转化为HT-2和T-2三醇；本研究中菌株AFJ-2的降解途径与Uneo的研究结果一致，并进一步结合芽孢杆菌AFJ-3共同降解T-2毒素，获得了新的产物4-脱乙酰NEO，同时这也是首次明确芽孢杆菌属菌株降解T-2毒素的代谢产物。迄今为止，国内外报道了多种微生物能够降解T-2毒素，而AFJ-2和AFJ-3在降解性能方面表现出一定的优势：Hassan等[25]在草莓酱中发现巨大芽孢杆菌344-1在44 h内仅去除78%的T-2毒素（0.6 μg/mL）；施琦[26]从自然环境中筛选的弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌，72 h对5 ng/mL T-2毒素的降解率分别为90.9%和85.5%；黑曲霉7 d内对5 μg/mL T-2毒素的降解率仅为69.8%[9]。本研究中AFJ-2和AFJ-3分别在7 h和12 h内能够去除99.9%的T-2毒素（5 μg/mL），降解效率均高于上述菌株，具有很大的应用潜力。

降解产物的安全性是决定降解菌株实际应用价值的重要指标之一。本研究中降解产物HT-2、T-2三醇、NEO和4-脱乙酰NEO均由T-2毒素水解侧链烷基酯键产生，而侧链烷基的数量与位置与T-2毒素的毒性息息相关[27-29]。C-4位取代基可抑制多肽链的延伸和终止[30]，研究表明，T-2毒素会优先脱去C-4乙酰基产生HT-2，但HT-2与T-2毒素毒性相差不大[31-32]；当C-15和C-4位均存在较大基团时，会抑制蛋白质合成的起始阶段，且C-4至C-15之间的大环（烃链）本身也具有毒性作用[27,30]，因此T-2毒素转化为T-2三醇后毒性降低99.64%[33]；C-8位异戊酰基的亲脂性使T-2毒素更易渗透到生物体，当C-8异戊酰基被取代生成NEO时，对小鼠淋巴瘤细胞的毒性显著降低了91%[27,30]。由上述研究可知，本研究中代谢产物的毒性均低于T-2毒素。通过降解位点推测出共代谢产物4-脱乙酰-NEO，由于目前市场上无标准品出售，未能通过二级质谱分析对它进行鉴定，根据侧链基团缺失的数量与位置推测其毒性低于另外3 种产物，但它的毒性机制尚不清晰。

多项研究表明，T-2毒素的水解过程主要由羧酸酯酶参与。大鼠肝微粒体中T-2毒素被代谢为HT-2，由特定酶抑制剂鉴定出是丝氨酸羧基酯酶的作用[34]，这与本研究中利用抑制剂PMSF得出T-2毒素降解酶中含有丝氨酸基团的结论一致；Johnsen[35]和Lin Nini[36]等同样采用酶抑制剂的方法，证明了人类血细胞和肝微粒体中的羧酸酯酶对T-2毒素具有水解作用；Lattanzio等[37-38]从玉米中纯化出具有酯酶活性的蛋白部分，该蛋白提取物能在90 min内将5 μg T-2毒素完全转化为HT-2。酶法降解真菌毒素具有显著的优势，但T-2毒素降解酶的鉴定至今未取得突破。根据本研究中的产物类型可知，菌株AFJ-2和AFJ-3产生的T-2毒素降解酶属于羧酸酯酶类，后续可借助分子生物学、蛋白质组学等手段，对该降解酶进行分离纯化。

本研究从小麦样品中分离获得2 株T-2毒素高效降解菌株AFJ-2和AFJ-3，由16S rDNA初步鉴定为短小杆菌属和芽孢杆菌属菌株。AFJ-2和AFJ-3分别能在7 h和12 h内将5 μg/mL T-2毒素完全降解；明确了2 株菌对T-2毒素的降解来源于细胞内产生的酶，不存在吸附作用；灭活与抑制剂（蛋白酶K、SDS和PMSF）处理会显著抑制胞内酶对T-2毒素的降解效果。菌株AFJ-2和AFJ-3分别将T-2毒素降解为低毒产物HT-2、T-2三醇和NEO，推测它们共同降解T-2毒素能产生新的产物4-脱乙酰-NEO，且AFJ-3能以HT-2为底物（AFJ-2能以NEO为底物）生成4-脱乙酰-NEO。本研究获得的微生物资源对T-2毒素的污染防控与酶制剂的开发应用具有重要意义。