瓦尼桑黄核苷类成分的液体发酵工艺优化及其细胞毒活性

祝梓旋, 张诗浩, 田 兴, 李雪妍, 邹 坤,尉小琴,李 啸,曾建红, 马明华, 王 倩, 刘呈雄*, 刘朝霞*

(1.三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室, 湖北,宜昌 443003;2.宜昌市森林火灾预防中心, 湖北,宜昌 443000; 3.宜昌人福药业有限公司,湖北,宜昌 443000)

瓦尼桑黄(Sanghuangporusvaninii)又称杨树桑黄,担子菌亚门(Basidiomycota)层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、针层孔菌属(Phellinus)真菌.研究表明,桑黄富含萜类、多糖类、核苷酸类[1]以及黄酮类等多种活性成分,具有抗肿瘤[2-3]、抗炎症、抗氧化、降血糖[4-6]、护肝等功效[7].目前市面上销售的桑黄主要有桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)、瓦尼桑黄以及粗毛纤孔菌(Inonotushispidus).与其他品种相比,瓦尼桑黄品质稳定,生长条件容易控制,可以进行人工栽培,是最易栽培的品种[8-9].

瓦尼桑黄在食品、药品等方面都有很好的开发应用价值[10-11].但野生桑黄稀少,且生长周期长,通过野生环境来获得桑黄子实体难以满足市场需求[12-13].液体发酵能够为菌丝生长提供最佳的营养,使菌丝快速生长,迅速扩繁,在短时间可达到一定生物量.与子实体培养相比,液体发酵技术不仅有周期短、效率高、规模大、质量稳定的优点,而且能对各种生长影响因子进行控制和优化,便于更好地从发酵液中分离提取活性物质,应用前景广阔[14].

核苷(nucleoside)是生物细胞维持生命活动的基本组成元素.在人体内,核苷可以干扰或直接参加核酸的新陈代谢[15],有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等活性[16],目前已开发成多种药品,如碘苷、利巴韦林、阿昔洛韦等[17].天然核苷类成分在各种动植物中均存在[18],在许多药用真菌中也富含核苷类物质[19-21],近年来从真菌中获取核苷类活性成分受到了越来越多的关注,如虫草中所含的虫草素、鸟苷、尿苷等被报道有抗肿瘤[22]、提高免疫力、抗菌等[23]药理活性;猴头菌所含核苷具有ABTS、DPPH等自由基清除活性而发挥抗氧化作用[24].目前,已有研究报道从瓦尼桑黄以及桑树桑黄子实体中测定并分离得到核苷类物质,有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等丰富的药理活性[1, 25],具有很好的开发应用价值,但与液体发酵相比,传统的子实体培养具有成本高、周期长和产品不稳定等缺点.为解决桑黄子实体培养的现实问题,本研究以核苷类成分为目标产物,优化桑黄液体发酵条件,并寻找影响桑黄核苷产量的关键因素以提高核苷产量,最终通过对瓦尼桑黄液体发酵条件、培养基配比、外源添加前体物质以及调控因子的工艺优化,使瓦尼桑黄液体发酵核苷产量提高了32.3倍,随后通过MTT法比较了发酵优化前后以及子实体核苷富集产物的体外细胞毒活性,为桑黄液体深层培养和进一步应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

供试菌株:瓦尼桑黄(Sanghuangporusvaninii)菌株QJF-8,保藏编号为CGMCC No.40120,由湖北省天然产物研究与利用重点实验室鉴定并保藏.

固体培养基:PDA(马铃薯葡萄糖琼脂).

液体种子培养基:葡萄糖20.00 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、硫酸镁0.50 g·L-1、氯化钠0.50 g·L-1、磷酸二氢钾0.50 g·L-1.

液体基础培养基:葡萄糖20.00 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、硫酸镁0.50 g·L-1、氯化钠0.50 g·L-1.

1.2 试剂药品

分析纯试剂:盐酸(国药集团)、氢氧化钠(国药集团)、葡萄糖(科密欧)、蔗糖(科密欧)、乳糖(科密欧)、甘露醇(麦克林)、磷酸二氢钾(麦克林)、氯化钠(国药集团)、L-谷氨酸(国药集团)、甘氨酸(国药集团)、无水硫酸镁(科密欧)、腺嘌呤(麦克林)、次黄嘌呤(麦克林)、DL-天冬氨酸(麦克林)、L-谷氨酰胺(麦克林)、槲皮素(麦克林)、丙酮酸钠(国药集团)、腺苷标准品(源叶)、1640基础培养基(普诺赛)、四季青胎牛血清(天杭生物)、MTT(Amersco)、胰酶(Gibco).

普通生化试剂:蛋白胨(奥博星)、酵母粉(索莱宝)、牛肉膏(奥博星).

1.3 仪器与设备

XQTY-50ES型振荡培养箱(上海知楚仪器)、LRH-150型生化培养箱(上海一恒科学仪器)、HIRAYAMA HVE-50型立式压力蒸汽灭菌器(日本Wade Stainless Kogyo)、FA1004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器)、UV-5500PC型分光光度计(上海元析仪器)、SW-CJ-2D型双人单面净化工作台(苏州净化设备).

1.4 瓦尼桑黄菌株培养

1.4.1 菌株的复苏 用PDA培养基,接种后在28 ℃条件下恒温培养14 d.

1.4.2 种子液体培养 取培养好的PDA固体母种5 mm 共5块于液体种子培养基中,装液量200 mL(每500 mL),在28 ℃、140 r·min-1条件下培养7 d后收集种子液.

1.4.3 发酵培养 将种子液培养好后,以10%体积分数接种于液体基础培养基中,装液量50 mL(每150 mL),在28 ℃、140 r·min-1条件下培养7 d.

1.5 瓦尼桑黄核苷产量测定

1.5.1 标准曲线的绘制 精密量取0.1 mg·mL-1腺苷标准品溶液(HPLC≥99%)1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,分别置50 mL容量瓶中,加水定容至刻度线,以相应的试剂为空白,照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典 2020年版》通则0401),在260 nm波长处测定吸光度,以吸光值为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线.如图1,标准曲线线性回归方程为:y=58.671x-0.0019(R2=0.9998).

图1 腺苷标准曲线

1.5.2 样品核苷产量测定 分别收集发酵液及菌丝体,菌丝体于50 ℃烘干至恒重后加10 mL纯水,在40 ℃温度下超声提取40 min.将发酵液与菌丝体提取液配成合适浓度的供试品溶液,参照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典 2020年版》通则0401),在260 nm波长处分别测定发酵液与菌丝体供试液吸光值,以相应培养基为空白,计算发酵液及菌丝体核苷总产量.

1.6 瓦尼桑黄核苷发酵条件单因素优化

1.6.1 接种量对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 按基础发酵培养基方案,设置接种量(体积分数,下同)分别为4%、6%、8%、10%、12%,装液量(每150 mL)、初始pH 7、28 ℃、140 r·min-1培养7 d,进行发酵试验,每组设3个重复.

1.6.2 培养温度对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 按基础发酵培养基方案,将温度梯度调整为20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃,装液量50 mL(每150 mL)、接种量10%、初始pH 7、140 r·min-1培养7 d,进行发酵试验,每组设3个重复.

1.6.3 初始pH对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 按基础发酵培养基方案,用1 moL·L-1HCl或NaOH溶液将发酵液初始pH梯度调整为4、5、6、7、8、9,装液量50 mL(每150 mL)、接种量10%、28 ℃、140 r·min-1培养7 d,进行发酵试验,每组设3个重复.

1.6.4 摇床转速对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 按基础发酵培养基方案,分别设置摇床转速为100、120、140、160、180 r·min-1,装液量50 mL(每150 mL)、初始pH 7、接种量10%、28 ℃培养7 d,进行发酵试验,每组设3个重复.

1.6.5 培养时间对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 按基础发酵培养基配制,设置培养时间梯度为1、2、3、4、5、6、7 d.装液量50 mL、初始pH=7、接种量10%、在28 ℃、140 r·min-1条件下培养,进行发酵试验,每组设3个重复.

1.7 瓦尼桑黄核苷液体发酵培养基优化

1.7.1 碳源、氮源的单因素筛选试验

碳源筛选实验:分别以20.00 g·L-1的蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇代替液体基础培养基中的葡萄糖,培养基其他组分不变,进行发酵试验,每组设3个重复.

氮源筛选实验:分别以5.00 g·L-1的蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉代替液体基础培养基中的酵母粉,培养基其他组分不变,进行发酵试验,每组设3个重复.

根据 《预算绩效管理工作规划(2012—2015年)》的要求，各级财政部门应加快对绩效指标的研究设计和修订补充，初步形成涵盖各类各项支出，符合目标内容，突出绩效特色，细化、量化的绩效指标。从近几年水利重大试点项目预算绩效管理工作实践来看，在预算项目绩效指标体系建设过程中应当遵循以下主要原则：

1.7.2 碳源、氮源正交试验 根据碳源与氮源的单因素筛选的结果,选择试验结果较好的碳源、氮源各两个:葡萄糖(A)、蔗糖(B)、蛋白胨(C)、牛肉膏(D)作为正交试验中的因素,设计L9(34)正交试验,各因素水平如表1所示.

1.7.3 无机盐正交试验 得到最佳碳氮比的培养基作为基础培养基,参考现有瓦尼桑黄培养基研究结果以及核苷合成代谢途径,选取MgSO4(E)、CaCl2(F)、ZnSO4(G)、MnSO4(H)作为正交试验中的4因素[19, 26-27],设计L9(34)正交试验,各因素水平如表2所示.

表2 无机盐正交试验设计表L9(34)

1.8 不同前体物质、调控因子及其浓度筛选试验

1.8.1 前体物质筛选 在核苷的从头合成途径过程中需要消耗L-谷氨酰胺、DL-天冬氨酸、腺嘌呤等前体物质[28].但在生物体内这些前体物质不仅用于产物的合成,还需为自身的生长和其它代谢活动提供充足能量,有关研究表明,通过外源添加前体物质能够有效提高核苷类物质的产量[29-30].本研究从此入手,选择次黄嘌呤、DL-天冬氨酸、腺嘌呤、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-谷氨酸作为试验对象,探究外源前体物质对瓦尼桑黄核苷产量的影响.在1.7试验基础上,分别在培养基中加入1 g·L-1不同前体物质:次黄嘌呤、DL-天冬氨酸、腺嘌呤、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-谷氨酸,每组设3个重复.

1.8.2 前体物质浓度筛选 根据试验1.8.1实验结果,选择腺嘌呤和次黄嘌呤,进行下一步浓度筛选试验.设置质量浓度为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 g·L-1七个水平的次黄嘌呤与腺嘌呤,每个水平重复3次.

1.8.3 调控因子筛选 核苷的生物合成涉及多种途径如磷酸戊糖途径、核苷酸的从头合成途径、补救途径等,并有多种代谢酶参与其中[31].已有研究证明可通过提高关键酶活性,或通过增加HMP途径碳流量、抑制糖酵解途径、调控传导通路等来提高核苷的生物合成[32-33].基于此,本研究在试验1.7基础上,分别在培养基中加入0.5 g·L-1不同营养物质:柠檬酸钠[20, 34]、丙酮酸钠[33, 35]、维生素B7、维生素B12[36]、槲皮素[32]、氟化钠[37]、硝普钠[38],每组设3个重复.

1.8.4 调控因子浓度筛选 根据试验1.8.3实验结果以及相关文献数据,设置质量浓度为1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 g·L-1六个水平的丙酮酸钠;0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 g·L-1六个水平的槲皮素,每个水平重复3次.

1.8.5 前体及调控因子正交试验 根据不同前体物质、调控因子及其浓度筛选试验结果,选择优化效果最佳的次黄嘌呤(I)、腺嘌呤(J)、丙酮酸钠(K)、槲皮素(L)作为正交实验的四因素.参考表3为L9(34)的正交实验设计表进行四因素三水平正交实验.

表3 前体及调控因子正交试验设计表L9(34)

1.9 瓦尼桑黄核苷类成分的细胞毒活性研究

1.9.2 MTT法测定富集产物对人肝癌细胞HepG2 的细胞毒活性

1) 样品溶液的配制.称取32.0 mg瓦尼桑黄发酵优化前后以及子实体的核苷富集产物,分别溶于100 μL DMSO中,充分摇匀溶解,配成2.4 mg·mL-1的样品溶液,在无菌操作台中使用0.22 μm微孔的灭菌滤膜过滤除菌,得到样品母液.随后将样品母液用1640培养基梯度稀释为5、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1的七个剂量组.

2) 富集产物对人肝癌细胞HepG2的细胞毒活性试验.选择处于生长对数期的人肝癌细胞HepG2,使用细胞计数仪,调整细胞悬液浓度为1×105个(每mL).接入96孔板中,孔板周围用100 μL空白培养基填充,并将96孔板第一个孔设置为调零孔,其余实验组每孔加入100 μL肿瘤细胞混悬液,充分振荡96孔板以保证各孔内细胞均匀分布,且每孔的细胞数量大致相同,每组设置3个复孔.将接种后的细胞板在37 ℃的5% CO2恒温培养箱中培养12 h.培养结束,分别加入不同浓度的样品溶液在37 ℃的5% CO2恒温培养箱中培养24 h,每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液,继续培养4～6 h后终止培养.用移液枪小心吸取孔内培养液,每孔加入150 μL DMSO溶液,用细胞培养板振荡器振荡5 min,使用酶标仪在492 nm下测定各孔吸光值,按照公式计算瓦尼桑黄核苷成分对肿瘤细胞生长的抑制率.抑制率的具体计算公式为:

抑制率=[1-D(492)试验/D(492)对照]×100%.

(1)

2 结果与分析

2.1 瓦尼桑黄核苷发酵条件优化

2.1.1 接种量对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 将不同接种量条件下的瓦尼桑黄核苷产量进行比较,结果如图2a.随着接种量的增加,瓦尼桑黄核苷产量也呈上升趋势,在接种量10%时达到最大值:9.13±0.42 mg·L-1.当接种量达到12%时,可能由于接种量过高,菌丝过早进入发酵终点,进而提前老化自溶产生了副产物,抑制了核苷产量.因此选择10%为最适接种量.

图2 不同培养条件对瓦尼桑黄核苷发酵的影响

2.1.2 培养温度对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 将不同培养温度条件下的瓦尼桑黄核苷产量进行比较,结果如图2b.如图所示,起初随着温度的提高,核苷产量无明显差异,但当温度提高至28 ℃时,随着温度的提高产量也随之增加,32 ℃时达到最大值10.03 ± 0.31 mg·L-1,超过32 ℃后又出现下降趋势,可见本试验中,稍高温度更利于目标产物的生成,因此选择32 ℃为最适的培养温度.

2.1.3 初始pH对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 将不同初始pH条件下的瓦尼桑黄核苷产量进行比较,如图2c可知,pH在4～7阶段时,核苷产量没有明显差异,在pH=7时产量达到最大13.24 ± 0.39 mg·L-1.但高于7后出现了明显的下降,说明中性及弱酸性更有利于瓦尼桑黄核苷成分的合成,而碱性条件会抑制核苷的生成,因此选择7为最适初始pH.

2.1.4 摇床转速对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 将不同摇床转速条件下的瓦尼桑黄核苷产量进行比较,结果如图2d,在100～140 r·min-1的转速范围内,随着摇床转速的增加,核苷产量也随之提高,转速超过140 r·min-1后,随着转速的增加核苷的产量反而有下降的趋势.因此瓦尼桑黄核苷发酵的最佳转速确定为140 r·min-1,在此条件下核苷产量为14.22 ± 0.44 mg·L-1.

2.1.5 培养时间对瓦尼桑黄核苷发酵的影响 将不同培养时间下的瓦尼桑黄核苷产量进行比较,结果如图2e所示,核苷产量在培养第3 d开始增长,在第5 d达到最大值15.33 ± 0.29 mg·L-1,培养时间超过5 d后略有下降.可能过长的培养时间导致出现菌丝体老化、初级代谢产物分解等现象,故选择最适培养时间为5 d.

综上所述,试验2.1对瓦尼桑黄产核苷的发酵条件进行了优化,单因素试验表明:接种量10%;培养温度32 ℃;初始pH为7;摇床转速140 r·min-1;培养时间5 d为最优发酵条件,在此最优条件下核苷产量为15.33 ± 0.29 mg·L-1.

2.2 瓦尼桑黄核苷液体发酵培养基成分优化

2.2.1 最佳碳源的选择 图3a为不同碳源培养基对核苷产量的影响,由图可知,蔗糖、葡萄糖、乳糖作为碳源时,瓦尼桑黄核苷产量高于其他碳源,表明瓦尼桑黄菌体对蔗糖、葡萄糖、乳糖的利用率较高,但考虑到蔗糖、葡萄糖价格更为低廉,因此选择蔗糖和葡萄糖作为正交试验中的碳源.

图3 不同碳源(a)、氮源(b)对瓦尼桑黄核苷发酵的影响

2.2.2 最佳氮源的选择 图3b为不同氮源培养基对核苷产量的影响,从图可以看出,瓦尼桑黄在含酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉的培养基中均能得到较好的生长,但在含蛋白胨、牛肉膏的培养基中核苷产量更高,因此选择蛋白胨和牛肉膏作为正交试验中的氮源.

2.2.3 碳源、氮源最佳组合确定 由表4可知,以核苷的产量作为正交设计优化的评价标准,极差值显示牛肉膏对核苷产量影响最大,其次是蔗糖,蛋白胨和葡萄糖影响最小.碳氮比最佳组合为A1B2C2D1:葡萄糖15.00 g·L-1,蔗糖20.00 g·L-1,蛋白胨5.00 g·L-1,牛肉膏2.50 g·L-1.

表4 C/N正交试验结果及极差分析

2.2.4 无机盐最佳组合确定 按照表2进行正交试验,以总核苷的产量为优化的评价标准,从表5可以看出4种无机盐对核苷含量影响从大到小依次为MnSO4、CaCl2、ZnSO4、MgSO4.各因素最佳组合为E2D3F2G1:MgSO41.00 g·L-1,CaCl21.50 g·L-1,ZnSO41.00 g·L-1,MnSO40.50 g·L-1.

表5 无机盐正交试验结果及极差分析

综上所述,试验2.2对瓦尼桑黄产核苷的液体发酵培养基进行了优化,通过单因素试验筛选得到了核苷利用率较高的碳源、氮源各两种,进而通过正交实验探究了最适碳氮组合以及最适无机盐组合,结果表明最优培养基配比为:葡萄糖15.00 g·L-1,蔗糖20.00 g·L-1,蛋白胨5.00 g·L-1,牛肉膏2.50 g·L-1,MgSO41.00 g·L-1,CaCl21.50 g·L-1,ZnSO41.00 g·L-1,MnSO40.50 g·L-1.

2.2.5 最佳培养条件以及培养基配比验证试验 根据上述实验所得最优发酵条件以及最佳培养基配比进行验证实验,在最优工艺下设置三组平行试验,测得核苷产量为21.05 ± 0.61 mg·L-1,该试验结果具有良好的重复性.

2.3 不同前体物质及浓度筛选试验

2.3.1 前体物质筛选 利用发酵法生产核苷时,培养基中含有嘌呤类或嘧啶类物质能够激活补救途径,从而直接利用前体物质用于产物合成,相比于从头合成途径,补救途径所含的酶促反应少,同时可以有效减少ATP的消耗,更有利于核苷的合成[20].

由表6可知,在培养基中加入各种前体物质,瓦尼桑黄液体发酵核苷产量均得到了提升.但加入1.00 g·L-1的腺嘌呤时,核苷产量最高,达到246.33 ± 7.3 mg·L-1;加入1.00 g·L-1的次黄嘌呤时核苷产量次之,达到223.38 ± 5.9 mg·L-1.核苷产量从高到低依次为:腺嘌呤、次黄嘌呤、L-谷氨酸、甘氨酸、DL-天冬氨酸、L-谷氨酰胺.

2.3.2 前体物质浓度筛选 图4为不同浓度腺嘌呤以及次黄嘌呤对瓦尼桑黄液体发酵核苷产量的影响.由图可知,加入次黄嘌呤和腺嘌呤的最佳浓度分别为1.50 g·L-1以及2.50 g·L-1,此时瓦尼桑黄核苷产量最高,分别为:247.68 ± 8.8 mg·L-1,281.10 ± 8.3 mg·L-1.

图4 不同浓度腺嘌呤(a)、次黄嘌呤(b)对瓦尼桑黄核苷发酵的影响

2.4 不同调控因子及浓度筛选试验

2.4.1 调控因子筛选 如表7所示为七种调控因子对瓦尼桑黄核苷产量的影响.当调控因子添加量为0.50 g·L-1时,丙酮酸钠组核苷产量最高,其次是槲皮素组.适当的丙酮酸钠对丙酮酸激酶产生抑制作用,因此部分葡萄糖不能通过糖酵解途径转化为丙酮酸,转而进入磷酸戊糖途径,通过嘌呤核苷酸途径合成核苷,从而提高了核苷产量[33, 35];槲皮素可以有效抑制XOD(黄嘌呤氧化酶xanthine oxydase)活性,减少了次黄嘌呤的分解,进而提高其转化率,此外,6-磷酸葡萄糖脱氢酶、腺苷琥珀酸合成酶与腺苷酸环化酶活性均得到显著提高,更多碳流分配到磷酸戊糖途径用于产物合成[32].综上所述,选择丙酮酸钠和槲皮素进行下一步的最佳浓度试验以及正交试验.

表7 调控因子筛选结果

2.4.2 调控因子浓度筛选 由图5可知,加入丙酮酸钠和槲皮素的最佳浓度分别为3.0 g·L-1以及0.15 g·L-1,此时瓦尼桑黄核苷产量最高,分别为:71.94 ± 1.60 mg·L-1、31.03 ± 0.33 mg·L-1.

图5 不同浓度丙酮酸钠(a)、槲皮素(b)对瓦尼桑黄核苷发酵的影响

2.5 前体及调控因子正交试验

以核苷的产量为优化的评价标准,从表8可以看出4种物质对核苷含量影响从大到小依次为次黄嘌呤、腺嘌呤、槲皮素、丙酮酸钠.各因素最佳组合为I2J2K3L3:次黄嘌呤1.50 g·L-1,腺嘌呤2.50 g·L-1,丙酮酸钠3.50 g·L-1,槲皮素0.25 g·L-1.

表8 前体物质及调控因子正交试验结果及极差分析

2.6 最佳条件验证实验

根据上述实验所得最优发酵条件以及最佳培养基配比进行验证实验,在最优条件下设置三组平行试验,测得核苷产量为291.16 ± 6.21 mg·L-1,验证结果与2.5实验结果相差较小,试验表明该最优条件成功提高了瓦尼桑黄液体发酵核苷产量且具有良好的重复性.

2.7 样品对人肝癌细胞HepG2的抑制率

如图6分别为发酵子实体、优化后以及优化前的瓦尼桑黄核苷富集产物对人肝癌细胞HepG2的抑制率.从实验结果可知,瓦尼桑黄核苷富集产物具有良好的人肝癌HepG2细胞毒活性.但优化后的富集产物活性更好,在5～320 μg·mL-1的浓度范围内,具有浓度依赖性,抑制率与浓度成正比,当样品浓度为320 μg·mL-1时抑制率达67.82%,经计算得其IC50值为76.33 ± 2.38 μg·mL-1.但优化前和子实体的核苷富集产物的抑制效果并不理想,在最高浓度时抑制率分别为22.41%、50.76%.

3 总结与讨论

本文通过单因素试验和正交试验相结合,优化了瓦尼桑黄液体发酵条件以及培养基配比,探讨了不同前体物质和调控因子对核苷产量的影响.实验所得最优发酵条件为:接种量10%、初始pH=7、培养温度32 ℃、摇床转速140 r·min-1、培养时间5 d.最佳培养基组分为:葡萄糖15.00 g·L-1、蔗糖20.00 g·L-1、蛋白胨5.00 g·L-1、牛肉膏2.50 g·L-1、MgSO41.00 g·L-1、CaCl21.50 g·L-1、ZnSO41.00 g·L-1、MnSO40.50 g·L-1、次黄嘌呤1.50 g·L-1、腺嘌呤2.50 g·L-1、丙酮酸钠3.50 g·L-1、槲皮素0.25 g·L-1.在该最优工艺下瓦尼桑黄液体发酵核苷产量为291.16 ± 6.21 mg·L-1,提高了32.3倍,且该产量高于目前所报道的传统培养方式子实体的核苷产量.

此外,本论文对液体发酵工艺优化前后的桑黄核苷类成分进行了体外细胞毒活性比较.实验证明,瓦尼桑黄核苷类成分具有良好的抑制人肝癌细胞HepG2活性,且优化后的核苷富集产物活性更好,优化后的富集产物对该细胞的抑制IC50值为:76.33 ± 2.38 μg·L-1.由此可见发酵工艺的优化不仅提高了瓦尼桑黄的核苷产量,其核苷类富集产物的体外细胞毒活性也得到了提高.

影响微生物发酵产核苷能力的因素主要有两个.一方面是随着核苷的生成,产物的原料以及ATP等能量的供应不足,对于这种情况,外源加入前体物质,通过补救途径进行生物合成是一种十分有效的解决方式[30, 40].另一方面,核苷的从头合成途径要涉及十步反应,代谢过程复杂,受多种代谢酶以及通路限制[41].因此调控代谢通路、改变合成途径中限速酶活性从而提高微生物的产核苷性能,也同样具有很好的研究意义.从图7瓦尼桑黄核苷产量优化趋势图可看出,在本实验中,前体物质供应不足是制约瓦尼桑黄产核苷性能的关键因素之一.在培养过程中添加适量的前体物质可以使瓦尼桑黄核苷产量大为提升.因此下一步试验可以深入考察更多前体物质以及不同添加方式等对瓦尼桑黄核苷产量的影响,使核苷产量进一步提高.

图7 瓦尼桑黄核苷产量优化趋势图