人工胃/肠液和大鼠肠道菌群对氟苯尼考磺胺噻唑稳定性的影响

朱兆晗,刘希望,杨亚军,白莉霞,秦 哲,李世宏,李 准,李剑勇*,葛闻博*

(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室,甘肃兰州 730050)

集约化养殖模式对抗生素的使用带来较大的挑战,由此加大了兽医临床中对动物疾病的治疗难度[1-3]。近些年来,在针对耐药性的新型抗菌药物研发过程中,除了对现有抗菌药物进行化学修饰的传统方法外,各种方法和策略应运而生[4]。多靶点疗法中的药物偶联是通过一定的化学方式修饰形成暂时性的键合[5],形成的前药在体外没有或药理活性很小,当在体内转化成原药后,才具有药理活性[6]。形成无活性或低于原药的前药,保持母体药物特性的同时能够改善其吸收和分布,在适当时刻和部位,经过水解,裂解掉连接基团,恢复生成原药,以此提高药物的总体效果。

氟苯尼考磺胺噻唑(florfenicol sulfathiazole,FST)是将氟苯尼考丁二酸酯的羧基端与磺胺噻唑的氨基端通过酰胺化修饰而成的一种新型偶联药用化合物。FST对多种细菌都具有良好的杀菌和抑菌效果,其中包括耐氟苯尼考在内的细菌。由于FST弥补了磺胺类药物对革兰氏阴性菌无效和对氟苯尼考(florfenicol,FF)细菌耐药的缺陷,具有广谱抗菌的特点,对多种细菌混合感染等复杂感染疾病具有较大的优势,临床用药成本将显著减少。为研制和开发FST口服制剂提供数据支持,本文模拟药物经口服在胃肠液中的环境变化,利用高效液相色谱法,考察胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃肠液的酸碱度及肠道菌群对FST稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 FST对照试验产品为本实验自制;磺胺噻唑(sulfathiazole,ST)和FF对照品,中国兽医药品监察所产品;盐酸、磷酸二氢钾和氢氧化钠,天津市光复科技发展有限公司产品;胰蛋白酶(T8150)、胃蛋白酶(P8390)和磷酸盐缓冲液(D1040-500),北京索莱宝科技有限公司产品;厌氧培养基(CM1513),北京陆桥科技股份有限公司产品;乙腈(色谱纯),赛默飞世尔科技有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 超高效液相色谱仪-紫外检测器(Waters 2489),甘肃沃德通用分析仪器有限公司产品;涡旋混合器(SIVortex-Genie 2),上海艾研生物科技有限公司产品;厌氧培养箱(Thermo Forma 1029),赛默飞世尔科技有限公司产品;水浴锅(XMTD-4000),郑州长城科工贸有限公司产品;分析天平(BT25S),梅特勒托利多科技公司产品;超净工作台(SW-CJ-2FD),苏州安泰空气技术有限公司产品;高压蒸汽灭菌锅(CT62A),驰通仪器有限公司产品。

1.1.3 实验动物 6只SPF级SD大鼠(♂),8～10周龄,190 g±10 g,购自中国农业科学院兰州兽医研究所,动物生产许可证号:SCXK20200002。试验开始前,大鼠经过1周时间适应。

1.2 方法

1.2.1 储备液与溶液 精密称取FST对照试验品、FF和ST对照品,用乙腈溶解,逐级稀释成1 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 人工胃液和无蛋白酶人工胃液的制备 按照《中国药典》[7]配制人工胃液和无蛋白酶人工胃液。

1.2.3 人工肠液和无蛋白酶人工肠液的制备 按照《中国药典》[7]配制人工肠液和无蛋白酶人工肠液。

1.2.4 大鼠肠道菌群的制备 参照毛茜等[8]研究,试验采取收集粪便,加生理盐水后匀浆,取上清液与厌氧培养基混合后,置于厌氧箱中培养12 h的方法制备肠道菌群培养液。

1.2.5 厌氧培养基的配制 厌氧培养基加水溶解,高压灭菌后,分装,4 ℃备用。

1.2.6 人工胃/肠液样品处理 精密移取4份FST对照品,每份250 μL,置于25 mL容量瓶,接着用配好的无蛋白酶人工胃/肠液、人工胃/肠液稀释至刻度。再吸取200 μL于1.5 mL EP管中(每个时间点3个平行),37 ℃水浴,于0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、 6.0 h后,向其中加800 μL冰乙腈,吹打混匀,4 ℃、13 000 r/min离心15 min,进样分析,用色谱峰面积的变化来探究pH和蛋白酶对其稳定性的影响。

1.2.7 大鼠肠道菌群处理 3 mL肠道菌群培养液中加300 μL FST对照品,吹打混匀,置于厌氧培养箱中,分别于0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h取出,0.6 mL混悬液中加0.9 mL冰乙腈,涡旋混匀,4℃、13 000 r/min离心15 min,进样分析,用色谱峰面积的变化来探究肠道菌群对其稳定性的影响。

1.2.8 含量测定色谱条件 见表1。

表1 色谱条件

2 结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 专属性 代表性色谱图见图1。用该色谱条件下,FST的保留时间为5.0 min,人工胃/肠液和无蛋白酶人工胃/肠液的色谱图在5.0 min附近无相应峰,说明人工胃/肠液和无蛋白酶人工胃/肠液对FST检测无干扰。

A.乙腈;B.FST;C.人工胃液;D.人工胃液+FST;E.无蛋白酶人工胃液;F.无蛋白酶人工胃液+FST;G.人工肠液;H.人工肠液+FST;I.无蛋白酶人工肠液;J.无蛋白酶人工肠液+FST;K.肠道菌群;L.肠道菌群+FST;M.氟苯尼考;N.磺胺噻唑。FST出峰时间5.0 min,紫外检测波长为285 nm。氟苯尼考出峰时间4.0 min,紫外检测波长为224 nm。磺胺噻唑出峰时间4.0 min,紫外检测波长为285 nm

2.1.2 线性关系的考察 将FST储备液用乙腈稀释,配制成浓度为0.5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的对照品溶液,进样分析,以FST浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,峰面积对分析物浓度的关系式,如图2所示,方程为:y=13 045x+1 000,R2=0.999 2,表明FST在0.5～100 μg/mL时呈良好的线性关系。

图2 FST的线性图

2.1.3 重复性结果 如表2所示,同一对照品溶液连续进样6次,得RSD值为0.84%,表明在该色谱条件下测得的FST峰面积的相对标准差符合分析试验的要求。

表2 方法重复性结果

2.1.4 精密度试验 FST低、中、高浓度在不同批次测定峰面积如表3所示。RSD值为6.21%、3.71%、4.68%,表明仪器精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.2 在人工胃/肠液中的稳定性

将不同时间含量用百分比表示,将未经水浴测得的峰面积记为100%。结果如图3所示,FST在人工胃液中孵育6 h,含量保持基本恒定。在人工肠液中孵育0～15 min,FST几乎完全降解,孵育30 min,降解完全。新出现的色谱峰在相同色谱条件下与FF和ST对照品出峰时间相同。表明FST分解为FF和ST,生成FF和ST的色谱峰面积和时间的关系如图4所示。

图3 FST在人工胃/肠液中含量变化曲线

图4 FST在人工肠液中孵育生成FF和ST的色谱峰面积

2.3 在大鼠肠道菌群中的稳定性

将不同时间含量用百分比表示,将未经水浴测得的峰面积记为100%。结果如图5所示,在孵育0～8 h时,FST在肠道菌群培养液中的剩余百分比迅速下降,8～12 h,FST基本保持恒定,降至50%。

图5 FST在肠道菌群中含量变化曲线

3 讨论

药物的稳定性是评价药物品质的重要环节,在药物吸收入血前,一切可能会对药物产生影响的因素都要考虑在内[9-18],可对后期化合物的结构修饰起到指导作用。提高生物利用度会使用药成本在一定程度上降低。对于口服给药,胃肠液的pH和蛋白酶是对药物稳定性的严峻考验[19-27],故将其作为制剂开发的研究内容是必要的。本试验采用高效液相色谱法,探究了人工胃/肠液和肠道菌群对FST稳定性的影响,结果发现,FST在人工胃液和无蛋白酶人工胃液中孵育6 h含量保持基本恒定;而在人工肠液和无蛋白酶人工肠液中孵育30 min,FST就已经完全降解,表明蛋白酶对其稳定性影响比酸碱性对其稳定性的影响小。并且在人工肠液孵育30 min后,检测不到FST,但出现了FF和ST的特征峰,且在1 h左右达到峰值,同时6 h内含量保持恒定,说明肠道环境会使FST在较短时间内代谢成前体药物,可对附植在肠道中的病原菌发挥抗菌作用。介于肠道中的细菌对抗生素有一定的降解作用[28-36],将大鼠粪便与FST共孵育,测定FST含量随时间的变化情况。结果表明FST剩余百分比与时间成反比,直到8 h趋于平稳状态,说明FST的降解会受到肠道菌群的影响,由此推测FST可能对肠道性疾病有一定的作用效果。

综上所述,酸碱性是影响FST代谢的主要因素,在胰蛋白酶、肠道菌群等作用下FST代谢产物为FF和ST。实验室前期的研究结果发现FST对小鼠体内肠道性疾病的治疗效果优于FF和ST,表明药物偶联比联合用药能更好的发挥抑菌作用,能够减轻联合用药给患畜带来的不良反应和依从性差的影响。结果证明,增加制剂稳定性是生物利用度得以优化的前提,同时也为体内试验的开展提供数据支持。