基于荧光光谱分析的玉米早期斑病害预测模型

王洪健, 于海业, 高山云, 李金权, 刘国鸿, 于 跃, 李晓凯, 张 蕾, 张 昕, 卢日峰, 隋媛媛*

1. 吉林大学生物与农业工程学院, 吉林 长春 130022 2. 吉林大学公共卫生学院, 吉林 长春 130021

引 言

据国际粮农组织(IAEA)估计, 全球每年有多达40%的作物因遭受病虫害而损失。 每年由病害造成全球农作物产量损失超过2 200亿美元, 约占粮食总产量的14%, 而由虫害造成的损失至少为700亿美元, 约占粮食总产量的10%[1]。 玉米是畜牧业、 养殖业的主要饲料来源, 也是食品、 医疗卫生、 轻工业、 化工业等行业不可或缺的原料之一。 《2020中国统计年鉴》显示, 2019年我国玉米种植面积为4 128.4万公顷, 产量为26 077.9万吨, 占谷物总产量的39.28%, 已跃然成为我国第一大粮食作物。 玉米斑病是玉米大、 小斑病的总称, 是由大斑病凸脐蠕孢菌(Exserohilumturcicum)与玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolarismaydis)侵染引起的叶片病害, 一种常见的严重疾病, 在全球玉米主产区均有爆发。 在我国东北、 西北春玉米主产区、 华北夏玉米主产区及南方高海拔山区该病害尤为严重, 主要造成果穗减少、 种子干瘪、 千粒重降低等影响。

玉米斑病害在整个生长周期均会发生, 苗期发病几率较小, 拔节期、 大喇叭口期、 抽雄期、 灌浆期、 乳熟期、 成熟期可完成多次侵染, 抽雄后病情逐渐加重, 传染速度极快, 范围广, 早期不易发现, 危害极大。 染病首年可减产约10%, 周年发病减产高达20%～30%, 严重威胁其品质与产量[2]。 传统的斑病害主要靠人工识别, 存在工作量大、 效率低等问题, 对病害的诊断具有一定的主观性, 且存在早期发病识别不及时的现象, 无法满足大规模精准诊断以及防范的需求[3-4]。 随着光谱技术的迅速发展, 国内外专家学者利用荧光光谱技术研究植物叶片病害规律, 进而反演叶片病害侵染情况。 叶绿素荧光光谱是一种可见光波段, 不同波段对植物水分和营养胁迫的生理状况反映不同, 可分析出其中包含的丰富的植物生长信息, 是研究植物生长信息及其与环境关系的灵敏探针。

基于荧光光谱分析植物病害的方法大致主要分为两类。 一类是基于荧光光谱提取病害敏感波段和建立光谱病害指数。 Francisc[5]等采集了燕麦蓝、 绿、 红、 远红四种单色光叶绿素荧光光谱后, 对其进行分析, 结果表明在光合作用的过程中红光与蓝光起促进作用。 Simone Graeff[6]等对小麦白粉病叶片不同波长范围(380.000～1 300.000 nm)的反射率与白粉病的相关关系进行了分析, 提取了小麦白粉病的敏感波段510.000～780.000 nm。 Davoud[7]等建立了小麦叶锈病两种光谱病害指数LRDSI_1和LRDSI_2, 估计值与观察值之间的R2高达0.94。 Kamlesh[8]等采用红边和神经网络技术对油棕橙斑病进行了检测, 并对四个著名的红边光谱指数SR、 RENDVI、 EVI2和Cired edge进行了评估。 Mohamad[9]等建立了六种油棕幼苗灵芝病害早期检测光谱指标Ratio1、 Ratio2、 Ratio3、 MSR7、 MSR15、 MSR19, 利用回归技术对光谱指标与叶片总叶绿素(TLC)之间的关系进行了分析。

另一类是与植物生理指标建立反演模型。 杨昊谕[10]等通过对黄瓜叶绿素荧光光谱进行分析, 选取荧光参数F732/F685与叶绿素相对含量, 对其建立模型, 该模型准确地反映了叶绿素相对含量与叶绿素荧光参数之间的关系。 有研究通过对冬小麦8个不同生长期叶片的反射光谱特性, 基于反射光谱与冬小麦叶片叶绿素含量建立预测模型, 该模型可以精准预测冬小麦叶片叶绿素含量。 杨艳阳[11]等从叶绿素荧光光谱分析的角度研究茶鲜叶叶绿素含量与荧光光谱之间的关系, 在修正了叶片含水率的基础上, 建立了茶鲜叶含水率的叶绿素相对含量与叶绿素荧光强度的数学回归模型。 Bassanezi[12]等利用染病叶片的健康部分荧光光谱评价叶片的染病情况, 采集锈斑病、 叶角斑病和炭疽病病变过程中的叶绿素荧光光谱, 发现三种病害都降低了叶片光系统Ⅱ的最大荧光强度和最佳量子产率。 Cherif[13]等以西红柿幼苗为试验对象, 研究了锌胁迫对植物叶绿素荧光的影响, 结果表明: 当荧光参数比F690/F735降低时, 表明受到了锌胁迫, 光合作用量子转换过程会受到影响。 Mandai[14]的研究结果表明霜霉病害可引起作物叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm的变化。

尽管国内外学者在环境胁迫、 病虫害识别、 生理信息监测做了大量研究, 但多数都是基于发病后对病斑面积的研究, 鲜有对潜伏期斑病叶片生理信息及荧光光谱的研究。 本研究基于荧光光谱技术与生理信息参数, 研究玉米关键生育期的病变规律, 提取敏感波段, 建立叶片病变的荧光光谱监测模型, 为玉米斑病害的快速、 定量监测提供强有力的技术支持。

1 实验部分

1.1 试验地与供试品种

2021年5月至8月, 实验于吉林大学生物与农业工程学院农业实验田(海拔高度150 m, 44°50′N, 125°18′E)进行。 供试土壤为东北典型黑土, 土壤参数如表1所示。 试验田长16 m, 宽12 m, 分为3个小区。 样品选用玉米“平安86”(来源于吉林大学农业工程实验室), 于2021年5月11日播种, 种植密度为行距0.6 m, 株距0.35 m, 亩约3 200株。 施肥方式以基肥一次性施用, N-P2O5-K2O为29∶13∶10, 有30%释放期为50～60 d的缓控释氮素, 施用量为45 kg·亩-1。

表1 供试土壤参数Table 1 Parameters of the test soil

1.2 试验设计

试验设置3个小区作为试验组, 分别为正常生长(无病灶)区16 m×8 m、 潜在发病(病害潜伏期)区16 m×4 m、 早期发病(早期发病状态)区16 m×4 m。 防止种植区间发生病菌传播, 以1.2 m为标准设置间隔。 使用人工接种斑病孢子法实现玉米不同斑病的感染程度, 在玉米拔节后期(13叶期), 株高约1 m开始试验。 于2021年7月17日, 通过喷雾接种的方式, 接种斑病分生孢子悬浮液(来源吉林农业大学植物病理实验室), 孢子密度为1×105～1×106个·mL-1, 接种量为5～10 mL·株-1。 玉米斑病的发病严重程度与接种的分生孢子量成正比, 潜在发病叶片接种1次, 早期发病叶片接种3次, 正常不发病叶片接种等量蒸馏水。 14天后, 诱发接种区域玉米开始出现斑病, 且发病程度相对一致, 能够满足研究观测要求。 其中玉米大、 小斑病参照中华人民共和国国家标准GB/T2339.1-2009《玉米大、 小斑病和玉米螟防治技术规范》, 试验中CK叶片为无病灶0级, 潜在发病叶片等级为0～0.5级, 早期发病叶片等级为0.5～2级。

1.3 光谱及生理参数的测量

于2021年8月1日、 3日、 6日斑病害发病盛期进行采样, 采样时间为9:00-14:00, 测量时天气晴朗, 采集不同组别叶片信息190片(其中对照组叶片∶潜在发病叶片∶早期发病叶片为20∶9∶9), 对玉米叶片的生理参数和荧光光谱数据同步采集, 生理参数包括相对叶绿素含量(SPAD)和光系统Ⅱ最大光化学量子效率(Fv/Fm)。

采用荷兰Avantes公司生产的AvaSpec-2048-USB2 型光纤光谱采集系统采集荧光光谱, 该系统的检测范围为331.010～1 099.960 nm。 设置光谱仪的激光发射探头与采集探头成45°角, 采集光谱时贴于活体叶片, 每片叶获取10条数据(取稳定初始光谱), 采用Ava Soft 7.8 for Ava Spec-USB2软件消除噪声、 仪器误差等因素对荧光光谱数据的影响。 大量研究表明SPAD值能精确反映作物体内的叶绿素含量, 本研究以叶片SPAD值来代表叶绿素含量。 使用日本Konica Minolta公司生产的SPAD-502测定SPAD值, 每片叶获取3条数据。 使用美国OPTI-SCIENCES公司生产的便携式脉冲调制叶绿素荧光分析仪(OS1P)测定Fv/Fm, 叶片充分暗适应20 min后进行测定, 每片叶获取3条数据取均值, 数据处理与分析采用MATLAB R2020b、 Origin2021 Pro、 和SPSS Statistics25.0软件。

1.4 数据集选取与划分

试验共采集玉米叶片样本190片, 剔除30片异常样本后按训练集∶预测集为3∶1合理划分, 分别为训练集样本120片, 验证集样本40片。 其中CK叶片训练集60片, 验证集20片。 潜在发病叶片训练集30片, 验证集10片。 早期发病叶片训练集30片, 验证集10片。

2 结果与讨论

2.1 玉米叶片生理参数对斑病响应规律研究

2.1.1 玉米叶片SPAD对斑病响应规律研究

叶绿素相对含量是评价植株光合作用效率和环境胁迫的重要指标, 也是解析光谱变化的敏感因子之一, 因此实时无损监测叶绿素状况对作物的农情监测、 产量估算具有重要意义[15]。

本研究在不同病害程度下, 获取玉米叶片SPAD的实测值, 结果如表2所示。 研究表明: 随着凸脐蠕孢菌与平脐蠕孢菌在叶片上附着与繁殖, 叶片坏死细胞数量增加, 椭圆形或纺锤形病斑面积扩大, 叶绿素含量大幅度下降, 叶片SPAD值降低, 叶绿素对光的合成与分解受到抑制, 叶片光合作用减弱。 随着斑病害程度的增加, 叶片萎蔫程度增加, 叶绿体结构受损, 尤其是在抽穗时期之后更加明显, 严重阻碍了玉米正常生长、 发育以及果实的形成。 综合以上分析表明: 可以利用SPAD值表征玉米斑病害规律。

表2 不同病害程度下SPAD实测值统计表Table 2 Statistical table of SPAD measured values under different disease degrees

2.1.2 玉米叶片Fv/Fm对斑病响应规律研究

Fv/Fm是PSⅡ的最大光化学量子产量或为PSⅡ潜在最大量子产量, 它反映的是PSⅡ反应中心均处于开放态时的量子产量, 一般恒定在0.80～0.85[16]之间。 当植物体受到光抑制、 环境胁迫或发生某些基因突变时,Fv/Fm值会出现显著变化。 所以, 荧光参数Fv/Fm广泛应用于植物光合作用和生理生化以及各种逆境胁迫对植物光合作用影响的研究, 可以采用其降低的幅度来衡量逆境胁迫对PSⅡ复合体损伤的程度, 反映逆境对植物光合作用的伤害程度[17]。

在不同病害程度下, 获取玉米叶片Fv/Fm的实测值, 结果如表3所示。 研究表明,Fv/Fm的减少幅度可以粗略地作为PSⅡ光抑制损伤的指标, 正常不发病叶片平均Fv/Fm为0.781, 潜在发病叶片平均Fv/Fm为0.751, 早期发病叶片平均Fv/Fm为0.726。 患病状态下,Fv/Fm显著下降(p<0.05), 早期患病状态下,Fv/Fm下降了7.04%, 潜在发病叶片Fv/Fm下降了3.84%。 可以看出, 潜在发病状态与发病初期, 叶片的SPAD值与Fv/Fm均显著下降, 且下降的幅度较大。 结果表明: 玉米植株在潜在发病与早期病害阶段Fv/Fm的减少会导致植株叶片的光合系统受损, 光合能力下降, 可以用Fv/Fm参数表征斑病害的生理参数规律。

表3 不同病害程度下Fv/Fm实测值统计表Table 3 Statistical table of Fv/Fm measured values under different disease degrees

通过对不同斑病害程度下叶片SPAD和Fv/Fm的综合分析表明: 随着斑病害严重程度的增加, 叶片SPAD和Fv/Fm均有不同程度的下降, 与前人的研究结论一致。 说明斑病害越严重, 玉米叶片PSⅡ反应中心开放比例和电子传递速率下降越快, 进而为光合作用提供的能量减少, 不利于后期玉米干物质的积累。

2.2 玉米叶片荧光光谱在不同病害程度下的差异性分析

采集叶绿素荧光光谱的过程中会出现不同光谱波段间的“抖动”现象, 对光谱指数运算结果造成一定偏差和影响, 不利于反映植株真实生理情况。 试验采用的叶绿素荧光光谱仪激光发射器发射波长是473.000 nm, 采集到的光谱波段范围是331.010～1 099.960 nm, 每一条光谱都具有1 355个光谱信息, 数据量冗余。 波段472.305～499.896 nm为激光器光源形成的光谱区域与波段900.000～1 099.960 nm 之间的荧光光谱呈现出趋于平缓稳定的小幅度波动。 对比多条光谱分析后, 发现此光谱波段波动范围较小, 对玉米叶片光合生理信息检测的影响较小。 因此, 以上两个波段均可视为本试验研究的无效光谱波段, 忽略不计。 500.000～900.000 nm的原始光谱、 FD光谱与SD光谱如图1所示。

图1 不同预处理叶片的荧光光谱特征Fig.1 Fluorescence spectrum characteristics of leaves with different pretreatment

对500.000～900.000 nm的原始光谱、 FD光谱与SD光谱进行峰值分析, 其结果如表4所示。 原始光谱经FD、 SD处理后, 多条光谱曲线呈现出一定规律变化的峰中心, 此时能够反映光谱性质的敏感波段增多, 表明其特征变量增多, 如图2(a, b, c)所示。 原始光谱峰中心出现在685.456与735.540 nm附近。 FD预处理光谱峰中心出现在676.896、 692.313、 748.573和750.271 nm附近。 SD预处理光谱峰中心出现在665.457、 668.318、 671.751、 685.465、 695.465、 698.015、 700.295和703.713 nm附近。 峰中心的荧光强度均表现出明显的波动和差异, 说明原始波段在该波段处存在极值, 可作为提取特征波长的敏感波段。

图2 光谱峰拟合图(a): 原始光谱拟合图; (b): FD光谱拟合图; (c): SD光谱拟合图Fig.2 Spectral peak fitting diagram(a): Original spectral fitting figure; (b): FD spectral fitting figure; (c): SD spectral fitting figure

表4 峰拟合结果Table 4 Peak fitting results

通过对原始光谱、 FD光谱、 SD光谱峰中心、 波峰波谷位置及相关系数的比较分析, 综合考虑荧光光谱的明显差异性, 从三种方法中选取最优的特征波长 (optimal characteristic wavelength, OCW)作为本试验研究对象, 其有效光谱波段为500.000～900.000 nm。

2.3 基于不同预处理方法的荧光光谱建模分析

2.3.1 反演模型的建立

以光谱敏感波段(OCW)作为模型输入量, 采用多元散射校正 (multivariate scattering correction, MSC)、 标准正态变量变换(standard normal variable transformation, SNV)、 多项式平滑(Savitzky-Golaay, S-G)、 FD光谱一阶导数预处理、 SD光谱二阶导数预处理等5种单一预处理方法, MSC-SG-FD、 MSC-FD-SG、 SNV-SG-FD、 SNV-SG-SD等4种建模组合方法对原始光谱进行处理, 采用梯度法选取校正集与预测集, 建立500.000～900.000 nm波段经典最小二乘(classical-least-squares, CLS)SPAD和Fv/Fm的荧光光谱反演模型。

2.3.2 建模方法比较与结果分析

以模型训练集和验证集的相关系数Rc和Rp, 均方根误差RMSEC和RMSEP, 作为模型效果评价标准。 相关系数越大, 均方根误差越小, 说明模型效果越好。 OCW预处理是选取的原始特征光谱, 以作为其他预处理方法的对照。 比较和分析利用不同模型反演估计玉米叶片生理参数的准确性, 以确定最佳建模方法。

(1)潜在发病叶片建模方法比较

对潜在发病叶片建立5种单一预处理方法与4种组合方法的荧光光谱反演模型, SPAD与Fv/Fm反演模型中训练集和预测集的相关系数Rc和Rp、 均方根误差RMSEC和RMSEP, 结果如表5所示。 研究表明: 在SPAD的反演模型中, 5种预处理方法模型的训练集相关系数Rc均在0.937 2以上, 均方根误差RMSEC均在5.47以下。 4种组合方法模型的训练集相关系数Rc均在0.930 2以上, 均方根误差RMSEC均在3.56以下。 4种组合方法的SPAD反演模型实测值与预测值的相关性如图3所示。 在Fv/Fm的反演模型中, 5种单一预处理方法模型的训练集相关系数Rc均在0.922 6以上, 均方根误差RMSEC均在7.45以下。 4种组合方法模型的训练集相关系数Rc均在0.944 7以上, 均方根误差RMSEC均在5.24以下。 4种组合方法的Fv/Fm反演模型实测值与预测值的相关性如图4所示。 SPAD与Fv/Fm反演模型整体效果和性能较好。

图3 潜在发病叶片SPAD反演模型实测值与预测值的相关性Fig.3 Correlation between measured value and predicted value of SPAD inversion model for potentially diseased leaves

图4 潜在发病叶片Fv/Fm反演模型实测值与预测值的相关性Fig.4 Correlation between measured values and predicted values of Fv/Fm inversion model for potentially diseased leaves

表5 潜在发病叶片不同建模方法的建模效果比较Table 5 Comparison of modeling effects of different modeling methods for potentially diseased leaves

在对潜在发病叶片建立反演模型并对比模型训练集的Rc和RMSEC之后, SPAD反演模型中SNV-SG-SD的效果最佳, 其相关系数Rc为0.985 2, 均方根误差RMSEC为1.59。 而SNV的模型效果最差,Rc为0.942 7, 均方根误差RMSEC为4.33。Fv/Fm反演模型中SNV-SG-FD的效果最佳, 其相关系数Rc为0.976 8, 均方根误差RMSEC为2.85。 而FD的模型效果最差,Rc为0.930 0, 均方根误差RMSEC为7.40。

(2)早期发病叶片建模方法比较

对早期发病叶片建立5种单一预处理方法与4种组合方法的荧光反演模型, SPAD与Fv/Fm反演模型中训练集和预测集的相关系数Rc和Rp、 均方根误差RMSEC和RMSEP, 结果如表6所示。 研究表明: 在SPAD的反演模型中, 5种单一预处理方法模型的训练集相关系数Rc均在0.936 6以上, 均方根误差RMSEC均在4.68以下。 4种组合方法模型的训练集相关系数Rc均在0.946 2以上, 均方根误差RMSEC均在3.94以下。 4种组合方法的SPAD反演模型实测值与预测值的相关性如图5所示。 在Fv/Fm的反演模型中, 5种单一预处理方法模型的训练集相关系数Rc均在0.887 3以上, 均方根误差RMSEC均在0.017 8以下。 4种组合方法模型的训练集相关系数Rc均在0.887 5以上, 均方根误差RMSEC均在0.020 0以下。 4种组合方法的Fv/Fm反演模型实测值与预测值的相关性如图6所示。 SPAD与Fv/Fm反演模型整体效果和性能较好。

图5 早期发病叶片SPAD反演模型实测值与预测值的相关性Fig.5 Correlation between measured value and predicted value of SPAD inversion model for early-onset leaves

图6 早期发病叶片Fv/Fm反演模型实测值与预测值的相关性Fig.6 Correlation between measured value and predicted value of Fv/Fm inversion model for early-onset leaves

表6 早期发病叶片不同建模方法的建模效果比较Table 6 Comparison of modeling effects of different modeling methods for early-onset leaves

在对早期发病叶片建立反演模型并对比模型训练集的Rc和RMSEC之后, SPAD反演模型中SNV-SG-SD的效果最佳, 其相关系数Rc为0.949 7, 均方根误差RMSEC为3.79。 而MSC的模型效果最差,Rc为0.936 6, 均方根误差RMSEC为4.19。Fv/Fm反演模型中SNV-SG-SD的效果最佳, 其相关系数Rc为0.943 8, 均方根误差RMSEC为0.011 7。 而MSC的模型效果最差,Rc为0.887 3, 均方根误差RMSEC为0.017 8。

由表5和表6可知, 4种建模组合方法下建模精度都在0.930 2以上。 组合方法对数据进行了重新整合和筛选, 提取了对数据信息系统解释性最强的综合变量, 减少了建模过程中严重相关性和峰中心提取不正确的影响, 使得SNV模型优于MSC模型。 对于反演模型中相关系数R2的研究表明: 其中SPAD的9种建模方法的相关系数R2, 无论训练集还是验证集均在0.92以上, 均方根误差都在5.0左右, 模型整体效果和性能较好。 其中Fv/Fm的9种建模方法的相关系数R2, 无论训练集还是验证集均在0.86以上, 均方根误差都集中在0.055左右, 模型整体效果和性能较好。 在反演模型的训练和验证集样本中, 同时分析了实测值与预测值之间的相关性。 结果表明: 无论是训练集还是验证集, 基于4种组合建模方法的实测值与预测值相关性较高, 基于5种单一的建模方法, 其模型的实测值与预测值相关性较差。

3 结 论

基于荧光光谱分析技术, 将光谱数据与生理参数相结合, 探究不同玉米斑病害程度下玉米叶片生理参数和光谱特性的响应规律, 同时构建了SPAD和Fv/Fm的快速无损检测模型。 结果表明:

(1)不同病害程度下玉米叶片的光谱特征存在差异性。 在波段600.000～800.000 nm内, 光谱反射率会出现明显的峰中心, 达到极值。 在波段900.000 nm之后, 反射率趋于平稳, 特征明显减少。

(2)可通过玉米叶片荧光光谱特性的变化表征病害的发病程度。 基于9种预测模型的分析来看, 组合方法的相关系数高于单一模型, 可以更加真实地反应叶片的生理信息和光合能力。

(3)对于潜在发病叶片, SPAD与Fv/Fm的最优模型均为SNV-SG-FD,Rc为0.985 2、 0.976 8。 对于早期发病叶片, SPAD的最优模型为SNV-SG-FD,Rc为0.949 7。Fv/Fm的最优模型为SNV-SG-SD,Rc为0.943 8。 该模型能够实现对早期斑病害玉米叶片SPAD和Fv/Fm的精准预测, 为作物胁迫状态的生理信息监测提供参考依据。

基于玉米叶片早期斑病害胁迫下的荧光光谱响应分析, 受栽培的玉米品种单一、 数量较少、 实验中取得的数据不够全面等条件的影响, 所得结论具有一定程度上的局限性。 针对于整个试验研究, 有待于进一步增加玉米试验品种、 扩大样本数量, 同时开展多因素水平的试验研究。 植物的光合作用是一个极其复杂的过程, 会受到玉米本身的品种、 生长状况的影响, 还会受到外界的光照强度、 光照时间、 温度、 空气湿度和土壤含水量等影响。 因此在实施周期性连续监测的过程中, 需结合外界环境因素加以考虑。