大黄鱼虹彩病毒胞内增殖以及2 个功能蛋白的细胞定位

杨西西 池洪树 郑在予 刘晓东 福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003

大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国养殖量最高的海水鱼类，福建是大黄鱼的主养区，产量占全国总量的83%[1]。1999 年何爱华等[2]通过从夏季暴发性死亡的大黄鱼幼鱼中发现虹彩病毒，陈新华等[3]也证明了1999-2001 年夏季福建省宁德、罗源等地养殖大黄鱼幼鱼暴发性死亡由虹彩病毒感染所致， 将其命名为大黄鱼虹彩病毒 （Large yellow croaker iridovirus，LYCIV）， 通过基因组测序证实该病毒为肿大细胞病毒属虹彩病毒。 肿大细胞病毒属虹彩病毒可感染超过100 种经济和观赏性海水鱼、淡水鱼，导致患病幼鱼病死率可达100%[4]。 肿大细胞病毒属的典型代表种是20 世纪90 年代末导致中国养殖鳜鱼暴发性死亡的病原， 即传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）[5]。 Dong 等[6]建立了对ISKNV 敏感的鳜鱼仔鱼细胞系 （Mandarin fish fry cell line 1，MFF-1），并制备了多种ISKNV 的蛋白特异性抗体。在前期研究中，本课题组利用MFF-1 细胞系成功从福建福鼎分离培养了大黄鱼虹彩病毒FD201807 株， 本研究对该毒株在MFF-1 上的增殖进行定量分析，并利用两种ISKNV 蛋白的特异性抗体对感染了FD201807株的MFF-1 细胞进行细胞间接免疫荧光试验，以期了解FD201807 株与ISKNV 是否有共同抗原，并对同源蛋白与细胞结合位点进行定位。

1 材 料

病毒FD201807 株由福建省农业科学院生物技术研究所分离保存；MFF-1、 特异性抗体ISKNVVP023 单克隆抗体和ISKNV-VP101 多克隆抗体由中山大学提供；组织基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；高糖DMEM 培养基，胎牛血清（FBS），含EDTA 和酚红的胰酶，青霉素和链霉素双抗，均购自美国Gibco 公司；TB GreenPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）购自宝日医生物技术（北京）有限公司；Triton X-100 购自广州威佳生物公司； 即用型正常山羊血清购自武汉博士德生物工程有限公司； 细胞核染料33342、Alexa Fluor 488 羊抗鼠IgG 绿色荧光二抗、Alexa Fluor 555 羊抗兔IgG 红色荧光二抗均购自美国invitrogen 公司；封片剂Fluoroshield（美国SIGMA 公司）。

2 方 法

2.1 病毒培养 将液氮中保存的1 mL MFF-1 细胞液加至新鲜DMEM 培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素）的25 cm2细胞培养瓶中，置于5%CO2培养箱内27 ℃培养，饱和湿度。 细胞长至单层铺满后，用0.25%胰酶消化、传代，再长至单层后用于病毒接种。 将保存于-80 ℃冰箱中的FD201807 株细胞培养物冻融3 次，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集上清，按1∶10 接种于新培养的单层MFF-1 细胞，80%细胞出现病变时冻存， 冻融后继续传代。

2.2 病毒定量分析 根据FD201807 的MCP 基因序列（Genbank：OQ475017），利用Primer Premier 5.0设计定量PCR 引物，Q-MCP-F：5′-CGGTATCACCAACGGTCAGACTATG-3′；Q-MCP-R：5′-GGCAGAGACACGGTAGGCAATG-3′；扩增片段为105 bp。将得到的阳性重组菌液扩大培养后，用Omega 质粒DNA 提取试剂盒提取质粒，超微量分光光度仪测质粒浓度，使用在线软件http∶//www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php 计算质粒的拷贝数。 将质粒稀释至108copies， 再进行10 倍连续稀释至101copies，共8 个梯度， 以此为标准质粒模板进行PCR 扩增，利用QuantStudioTMDesign & Analysis software 软件分析，制作标准曲线，分别以FD201807 第3 代、6 代、8 代、10 代、12 代、15 代病毒DNA 为样品，以MFF-1 细胞冻融液为阴性对照，超纯水为空白对照，进行绝对定量PCR 扩增。通过标准曲线计算不同代次病毒DNA 的拷贝数。 反应体系：TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，Q-MCP-F（10 μM）0.8 μL，Q-MCP-F （10 μM）0.8 μL， 模板DNA 2.0 μL，补ddH2O 至总体积20.0 μL。 定量PCR 反应程序，预变性：95 ℃、30 s；PCR 反应：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环；熔解曲线分析：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。

2.3 病毒的细胞荧光定位 将细胞接种于24 孔板上， 待细胞长满单层后， 接种适量第14 代病毒液，5%CO2培养箱内27 ℃恒温培养至细胞病变率达80%左右时，弃去培养基，加入200 μL -20 ℃预冷的无水甲醇固定15～20 min，加入200 μL 0.2% Triton X-100 透化15 min，10%山羊血清室温静置封闭1 h， 分别加入1∶5 000 稀释的ISKNV-VP23 鼠单抗血清、1∶1 000 稀释的ISKNV-VP101 兔多抗血清作为一抗，双抗组同时加入两种一抗血清，对照组加等量0.2 M PBS（pH7.2），室温孵育1 h，分别加入相应的Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠IgG 绿色荧光二抗和Alexa Fluor 555 标记的羊抗兔IgG 红色荧光二抗， 双抗组同时加入两种荧光二抗， 对照组加等量0.2 M PBS（pH7.2），室温避光孵育1 h，加入1∶1 000细胞核染料，室温避光孵育15 min，小心滴加少许封片剂Fluoroshield，以保持细胞湿润，避免气泡产生，立即放在共聚焦显微镜下观察并拍照。病毒接种至核染每步骤结束后均用0.2 M PBS (pH7.2) 清洗3 次，每次5 min。

3 结 果

3.1 绝对定量检测不同代次FD201807 病毒拷贝数将MCP 基因连接在pMD-19T 载体上获得重组阳性菌液，提取重组质粒，测得浓度为130.723 ng/μL，估算其拷贝数约为2.94×1010copies/μL。根据荧光定量PCR 结果制作标准曲线，y=-2.898logx+33.641（见图1）， 以此标准曲线计算得到细胞中不同代次FD201807 病毒的拷贝数 （见表1）。 显示不同代次FD201807 病毒的拷贝数均在106～108copies/μL。

表1 不同代次FD201807 病毒液浓度

图1 荧光定量PCR 中单位病毒拷贝数的CT 值标准曲线

3.2 细胞间接免疫荧光结果 细胞间接免疫荧光试验结果见图2， 图中的细胞为病变率达80%以上的接毒细胞，同时使用ISKNV-VP23 鼠单抗血清和ISKNV-VP101 兔多抗血清作为一抗孵育， 其中A、B、C、D 为同一拍照区域在不同激发光下的图片，蓝色显示细胞核， 绿色显示ISKNV-VP23 鼠单抗血清，红色显示ISKNV-VP101 兔多抗血清。

图2 FD201807-P14 感染MFF-1 72 h细胞间接免疫荧光照片

几乎所有蓝色的核染细胞均出现绿色和红色荧光， 且细胞核大小不一、 形状也不均匀， 结合了ISKNV-VP23 鼠单抗的绿色荧光蛋白均定位在细胞膜， 结合了ISKNV-VP101 兔多抗的红色荧光蛋白均定位在细胞质。

4 讨 论

由于病毒的特殊性， 若没有合适的细胞系来培养病毒， 则无法深入开展病毒的相关研究。 自1999 年发现首例LYCIV 感染以来[2]，LYCIV 的研究进展缓慢， 二十年来开展的LYCIV 研究主要集中于病毒检测方法的建立和部分功能基因的分析[7-10]。2008 年Dong 等[6]建立了对ISKNV 敏感的鳜鱼仔鱼细胞系（Mandarin fish fry cell line 1，MFF-1），并制备了多种ISKNV 的蛋白特异性抗体。 由于LYCIV与ISKNV 都属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属，且ISKNV 是代表株，它们存在较高的亲缘关系，所以本研究用MFF-1 培养FD201807 株，通过荧光定量PCR 测定病毒拷贝数，并用ISKNV 的特异性抗体来检测感染MFF-1 的FD201807 病毒，看它们是否存在共同抗原。

绝对荧光定量结果显示， 不同代次FD201807病毒的拷贝数均在106～108copies/μL， 说明其可在MFF-1 细胞上增殖复制，MFF-1 适合FD201807 毒株的胞内增殖。基于ISKNV-VP23 和ISKNV-VP101的细胞间接免疫荧光结果显示，FD201807 病毒感染的MFF-1 细胞核均表现为大小不一、 形状也不均匀，很可能是病变细胞发生了细胞核损伤，而受感染程度不同导致细胞核损伤程度差异。 ISKNV-VP23鼠单抗和ISKNV-VP101 兔多抗均可与感染FD201807 的MFF-1 细胞发生荧光反应， 说明FD201807 与ISKNV 存在共同抗原。结合了ISKNVVP23 鼠单抗的绿色荧光蛋白定位在细胞膜， 说明FD201807 上与ISKNV-VP23 同源的蛋白可能是膜结合蛋白， 而结合了ISKNV-VP101 兔多抗的红色荧光蛋白定位在细胞质， 说明FD201807 上与ISKNV-VP101 同源的蛋白可能在胞质中组装。ISKNV-VP23 蛋白表达于ISKNV 感染细胞的质膜上，不能作为病毒囊膜蛋白[11]，FD201807 中与之同源的是层粘连蛋白型表皮生长因子样蛋白， 免疫荧光说明它可能与ISKNV-VP23 一样表达于感染细胞的质膜上。

目前国内外关于LYCIV 的研究报道还很少，有必要加强对LYCIV 的侵染以及致病机制的研究，为鱼类LYCIV 疫苗的开发提供依据。