基于脑-肠轴探讨电针与双歧杆菌对单纯性肥胖大鼠肠源性信号物质及脂代谢的影响

颉媛媛,钱虹宇,谢顺铠,许 婧

肥胖病是由于体内摄入大于消耗,造成脂肪堆积和(或)分布异常,进而导致体质量增加的慢性疾病,是造成2型糖尿病和各种心血管疾病发生的危险因素[1]。至2016年,全球18岁以上(含18岁)的人群接近20亿人超重,且其中约1/3系肥胖[2]。目前针对肥胖的疗法多样,但疗效存在参差,而针灸治疗肥胖疗效确切,安全性高,专家推荐意见为A(证据极有效)[3]。

中医理论强调整体观,以藏象理论为基础,认为脑肠二者之间在生理及病理方面密切相关[4]。脑-肠轴是中枢系统和胃肠道系统构成的双向信号传导系统[5]。中枢神经系统是脑-肠轴负反馈调节的核心,整合并向外周组织发出脑部及胃肠道传达的信号胃肠道系统接收信号,共同调节能量平衡从而达到控制体质量的目的[6]。该实验研究通过对比电针与双歧杆菌对单纯性肥胖大鼠生存状态、肠源性信号物质[肠嗜铬细胞(enterochromaffin cell,ECC)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、组胺(histamine,HIS)]水平、血脂[三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)]水平等的影响,验证电针疗法的优效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物购入体质量在40～60 g范围内的4周龄SPF级SD大鼠60只(雌雄各半)。实验动物均来自于成都达硕实验动物有限公司,喂养条件为12 h明暗交替,室温22～25 ℃,湿度40%～70%。动物购入后适应性喂养1周,期间饲以基础饲料,自由摄食饮水。

1.2 主要试剂与仪器ELISA试剂盒购自武汉Elabscience公司;六胺银染液套装购自武汉Servicebio公司;生化试剂盒购自深圳Mindray公司;双歧杆菌三联活菌胶囊购自晋城海斯制药有限公司(国药准字S19993065);G6850-Ⅱ型电针仪购自上海华谊医用仪器有限公司;电子天平购自上海越平科学仪器(苏州)制造有限公司;台式高速冷冻离心机、涡旋混合器、台式高速微量离心机购自美国赛洛捷克公司;数显气浴恒温振荡器购自常熟朗越仪器制造有限公司;全自动生化分析仪购自深圳迈瑞医疗器械有限公司。

1.3 模型制备及分组

1.3.1模型制备 适应性喂养结束后,按照随机原则,将大鼠按1～60编号,采用随机数字法进行初次分组,其中50只为高脂组,给予高脂饲料(配方:每200 g普通大鼠饲料中添加猪油50 g,白糖150 g,奶粉20 g,鸡蛋1个)进行喂养,其余10只为普食组,给予普通饲料(配方:水分94 g/kg、蛋白质190 g/kg、脂肪51 g/kg、粗纤维36 g/kg、灰分62 g/kg、钙11.3 g/kg、磷8.6 g/kg),造模期间大鼠自由摄食饮水,待高脂组体质量大于普食组体质量 20%者定为单纯性肥胖大鼠[7]。

1.3.2分组 饲养8周后,造模成功30只(雌雄各半),将其随机二次分组分为模型组、电针组、双歧杆菌组,每组10只(雌雄各半);普食组的10只(雌雄各半)作为空白组。

1.4 干预措施

1.4.1空白组 继续饲以普通饲料,与电针组同法捆绑固定,7 g/kg生理盐水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.2模型组 继续饲以高脂饲料,与电针组同法捆绑固定,7 g/kg生理盐水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.3电针组 继续饲以高脂饲料,选取双侧天枢、丰隆,穴位定位参照《实验针灸学》[8]的动物穴位图谱。将该组大鼠以仰卧位固定在鼠台上,露出其腹部与后肢。将治疗穴位 2 cm×2 cm面积区域的毛发剃除干净,并酒精棉球对电针穴位进行消毒;使用针灸针刺入皮下25 mm左右,以平补平泻法运针约1 min后,连接电针治疗仪,选用频率为2 Hz,强度为1.5 V的连续波,观察大鼠下肢及针柄变化,以轻微节律抽搐为度,留针30 min,7 g/kg生理盐水灌胃1次/天,6次/周,两侧穴位交替治疗。

1.4.4双歧杆菌组 继续饲以高脂饲料,与电针组同法捆绑固定,双歧杆菌溶液灌胃治疗。双歧杆菌三联活菌胶囊用生理盐水以100 mg/ml配制,现配现用,7 g/kg灌胃[9],1次/天,6次/周。

1.5 取材及检测

1.5.1取材 治疗结束后,大鼠禁食不禁水12 h,以1%戊巴比妥钠(30 ml/kg)予腹腔注射麻醉后,开腹收集大鼠腹主动脉血液4 ml左右,1 500 r/min 4 ℃离心15 min,使用移液枪将上层血清移至EP管中,-80 ℃保存备用;另外,迅速取出结肠组织、下丘脑组织等样本,置于液氮中备用。

1.5.2体质量检测 固定每周一上午9:00测量大鼠体质量、摄食量并记录。

1.5.3ELISA检测 5-HT、HIS等指标采用ELISA法测定。结肠、下丘脑组织标本研磨匀浆取上清液待用,提前20 min取出试剂盒和样本,平衡至室温;配制所需要的试剂及工作液;微孔板法测定各指标水平。

1.5.4银染色检测 通过对结肠组织标本石蜡切片脱蜡至水、媒染剂染色、工作液配制、组织酸化、孵育染色、显色、六胺银染液处理、复染、脱水封片、显微镜镜检等程序测定结肠ECC阳性细胞水平。

1.5.5生化检测 通过对血清标本BCA定量处理之后采用生化仪对TC、TG、LDL、HDL水平进行检测。

2 结果

2.1 各组大鼠生存状态造模前各组大鼠活动度、毛发光泽度均较正常;造模后,除空白组外,其余各组大鼠活动度、毛发光泽度降低;治疗结束后,各治疗组大鼠活动度、毛发光泽度好转。

2.2 各组大鼠体质量造模前,各组大鼠体质量差异无统计学意义;干预前,与空白组比较,其他各组大鼠体质量升高(P<0.05),模型组、电针组、双歧杆菌组体质量比较差异无统计学意义;干预后,与空白组比较,模型组体质量升高(P<0.05);与模型组比较,电针组与双歧杆菌组体质量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,电针组较双歧杆菌组体质量降低明显。见表1。

表1 各组大鼠干预前后体质量

2.3 各组大鼠摄食量干预前,各组大鼠摄食量差异无统计学意义(F=1.48,P>0.05);干预后,与模型组比较,电针组与双歧杆菌组摄食量下降,差异有统计学意义(F=89.32,P<0.05),且电针组较双歧杆菌组摄入量下降明显。见图1。

图1 各组大鼠干预前后摄食量比较

2.4 各组大鼠肠源性信号物质

2.4.1各组大鼠结肠ECC阳性细胞水平 干预后,与空白组比较,模型组大鼠结肠ECC阳性细胞水平升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、双歧杆菌组大鼠结肠ECC阳性细胞水平降低(P<0.05),且电针组较双歧杆菌组降低明显,差异有统计学意义。各组大鼠干预后结肠ECC阳性细胞水平方差分析F=366.35。见图2、3。

图2 各组大鼠干预后结肠ECC阳性细胞水平

图3 各组大鼠结肠ECC银染色照片 ×400

2.4.2各组大鼠结肠与下丘脑5-HT、HIS水平 干预后,与空白组比较,模型组大鼠结肠及下丘脑中5-HT、HIS升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、双歧杆菌组大鼠结肠及下丘脑中5-HT、HIS降低(P<0.05),且电针组相关指标较双歧杆菌组降低明显,差异有统计学意义。各组大鼠干预后结肠和下丘脑5-HT水平方差分析F=2 933.36、807.78;结肠和下丘脑HIS水平方差分析F=826.19、103.66。皮尔逊相关性检验显示结肠中ECC水平与5-HT、HIS在0.01级别(双尾)相关性显著,相关系数Γ值为0.85、0.98。见图4、5。

图4 各组大鼠干预后结肠与下丘脑5-HT水平

图5 各组大鼠干预后结肠与下丘脑HIS水平

2.5 各组大鼠血脂水平干预后,与空白组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL水平升高, HDL水平降低(P<0.05);与模型组比较,电针组血清TC、TG、LDL水平降低(P<0.05),差异有统计学意义,HDL水平虽升高,但差异无统计学意义(P>0.05),双歧杆菌组干预后血清TC、TG水平降低(P<0.05),差异有统计学意义,LDL 、HDL水平虽有改变,但差异无统计学意义(P>0.05),且电针组较双歧杆菌组的血脂相关指标更接近空白组。各组大鼠干预后TC、TG、LDL、HDL水平方差分析F=4.59、3.78、2.50、1.64。见图6。

图6 各组大鼠干预后血脂水平

3 讨论

研究[10]表明电针治疗高脂饮食诱导的肥胖疗效确切,具有安全性高、价格低廉,患者接受度高等特点。腧穴是电针的施术部位,准确选穴是电针取效的关键之一。有研究[11]显示在治疗肥胖的腧穴处方配伍规律中,天枢穴和丰隆穴是针灸治疗肥胖的有效腧穴配伍。天枢穴和丰隆穴均是足阳明胃经腧穴,天枢穴是大肠经的募穴,位于人体上下之气交合处,为升清降浊之枢纽;丰隆穴是胃经的络穴,一络通两经,属阳而络阴,二者结合使用可健脾和胃,调和肠胃,调畅中焦。双歧杆菌是放线菌门中最主要的一种有益菌,对肠道功能甚至机体的平衡都有很大的影响,但其作为一种活性菌,不便于储存,且长期服用可能会导致肠道产生依赖性而使机体本身的菌群失活。该实验选择高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型是因其与人类肥胖类型相似,具有较高的研究价值。课题组前期研究表明针灸可以对机体的基础代谢活动起到良性调节,加速脂肪代谢,还可抑制胃肠活动,降低食欲和营养物质的吸收,调节肠道微生物的物种丰度。该实验研究基于脑-肠轴,以肠内分泌系统的信号中转和传递为切入点,观察显示长期高糖高油饮食可诱导健康大鼠肠源性信号物质的变化并通过脑-肠轴向中枢递呈,使之自下而上刺激下丘脑对机体作出反应,大鼠摄食增加,代谢减缓,发生肥胖。电针和双歧杆菌疗法均可改善因高脂饮食诱导的肥胖状态,提高肥胖大鼠的生存水平,且电针的治疗效应与双歧杆菌相比在调整相关肠源性信号物质水平刺激下丘脑控制摄食方面优势明显,可加快脂代谢,减轻体质量,是治疗肥胖的优势手段。针灸治疗疾病强调整体观,其起效机制具有多层面、多环节、多靶点的特点,现代研究也表明针灸疗法对肥胖患者的代谢水平、胃肠道系统等多个机体系统具有调节作用,而当前多数开展的研究切入点较散在,探索针灸治疗肥胖的整体效应机制将会成为更进一步的目标,有助于为针灸治疗肥胖提供有力的研究证据支持。

该实验研究尚存在一些不足,如实验设计时未加入假电针组进行对比研究、仅做了观察性的研究未进行深层次的机制研究等,导致结果较局限。需要在后续工作中加以深入研究。