circ-RACGAP1在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制

胡 志,付 桥,徐 律,张 炜,盖强强,孙 伟

膀胱癌是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率及病死率均居泌尿系统肿瘤第一位[1]。随着医疗水平的进步,膀胱癌患者的预后得到改善,但是膀胱癌的发病率呈增加趋势,并且其复发率非常高[2]。探究膀胱癌发病的分子机制,明确新的诊断标志物和治疗靶点是膀胱癌研究的当务之急。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种没有蛋白编码功能的RNA转录产物,参与细胞的分化、应激、损伤修复等过程,是关键的转录调控因子[3]。circRNA在多种肿瘤包括输尿管癌、胆管癌、淋巴瘤、膀胱癌中呈现异常表达,发挥促癌或抑癌的作用[4-6]。根据circBase数据库显示,circ-RACGAP1来源于RACGAP1基因的第19、20、21和22外显子,经剪接后形成的环状转录本,circ-RACGAP1在膀胱癌中的作用及机制并不清楚。该研究主要探究circ-RACGAP1在膀胱癌中的表达水平及其与膀胱癌患者临床资料的关系,明确circ-RACGAP1在膀胱癌细胞中的作用和分子机制,意在为膀胱癌的诊疗、预后评估提供新的标志物和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1、人膀胱癌细胞系5637、T24、J82、RT-4、UM-UC-3购自美国ATCC公司。一抗兔抗Rac-GTP酶激活蛋白1(rac-GTPase activating protein 1,RACGAP1)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)均购自美国Santa Cruz公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Life Technologies公司。DMEM培养基、双荧光素酶报告检测试剂盒购自以色列Biological Industries公司。Transwell小室、circ-RACGAP1敲降质粒(sh-circ-RACGAP1:AACACTCCTAGAAATCACAGA)和对照质粒购自美国Millipore公司。miR-NC、miR-4324购自美国BD公司。逆转录试剂盒购自北京天根生化公司。circ-RACGAP1双荧光素酶报告载体野生型(WT)和突变型(MUT)购自上海碧云天生物技术公司。

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1.2 生物信息学分析通过TCGA数据库分析膀胱癌组织和正常膀胱组织中circ-RACGAP1的表达水平及其与患者临床分期的关系。circ-RACGAP1与miR-4324的靶向关系采用deepBase、Circbank、CircInteractome、circRNABase数据库进行分析。

1.3 细胞培养与分组将5637、T24、J82、RT-4细胞置于含12% FBS的RPMI-1640培养基,将SV-HUC-1、UM-UC-3细胞置于含12% FBS的DMEM培养基,在加湿培养箱中常规培养。将T24细胞接种于12孔板,分为对照组(转染对照质粒)和sh-circ-RACGAP1组(转染circ-RACGAP1敲降质粒)。T24细胞汇合度至70%,每组均采用LipofectamineTM3000试剂转染0.6 μg质粒至T24细胞。

1.5 克隆形成实验检测sh-circ-RACGAP1对T24细胞增殖的影响将circ-RACGAP1敲降质粒转染T24细胞48 h后,采用胰酶消化并用移液器吹打,将单细胞悬液以每孔2 000个接种6孔板,保证T24细胞均匀分布,在加湿培养箱中培养。待11 d后出现克隆时,吸去培养基,PBS溶液漂洗4次。加入甲醛固定50 min,PBS溶液漂洗4次,加入结晶紫染色40 min,PBS溶液漂洗4次,超净台内晾干后计数克隆形成数。

1.4 qPCR法检测circ-RACGAP1、miR-4324表达水平以TRIzol法提取膀胱癌细胞总RNA,进行逆转录合成cDNA。qPCR反应条件:93 ℃预变性3 min,93 ℃ 40 s、56 ℃ 40 s、71 ℃ 40 s,总共进行34次循环。引物序列:circ-RACGAP1正向引物:CCTGTGACCACTCCTGAACA,反向引物:CATGGCAGCTATGCTGTTGT;miR-4324正向引物:CAGGTCCTTGCTCTCCAACTTGC,反向引物:TGATCACATTTAACAGCTTCCG;GAPDH正向引物:TGCCACTCAGAA-GACTGTGG,反向引物:TTCAGCTCTGGGATGACCTT。circ-RACGAP1、miR-4324表达水平计算采用2-ΔΔCt公式。

1.6 划痕实验检测sh-circ-RACGAP1对T24细胞迁移的影响将circ-RACGAP1敲降质粒转染T24细胞48 h后,采用胰酶消化并用移液器吹打,将单细胞悬液以每孔2×105个接种6孔板,在加湿培养箱中培养。细胞汇合度为90%左右,取无菌移液器枪头,于板底均匀划痕,用显微镜取4个视野测距。在加湿培养箱中培养24 h,用显微镜取4个视野测距,计算T24细胞的迁移率。

1.8 双荧光素酶报告基因实验检测circ-RACGAP1和miR-4324间的靶向关系将T24细胞接种于12孔板,分为circ-RACGAP1-WT+miR-NC组、circ-RACGAP1-WT+ miR-4324组、circ-RACGAP1-MUT+miR-NC组、circ-RACGAP1-MUT+miR-4324组。T24细胞汇合度至70%,每组均采用LipofectamineTM3000试剂转染0.9 μg质粒至T24细胞。在加湿培养箱中培养46 h后,用双荧光素酶报告检测试剂盒分析每组T24细胞的荧光素酶活性。

1.7 Transwell实验检测sh-circ-RACGAP1对T24细胞侵袭的影响将基质胶加入Transwell上室,保证基质胶均匀分布。将circ-RACGAP1敲降质粒转染T24细胞48 h后,采用胰酶消化并用移液器吹打,将无血清的单细胞悬液以每孔2×104个加入上室,下室加含20%FBS的培养基,在加湿培养箱中培养48 h。棉签擦去基质胶和未穿膜T24细胞,多聚甲醛固定50 min,结晶紫染色50 min。用显微镜取4个视野,计数细胞侵袭数。

1.9 Western blot法检测sh-circ-RACGAP1对T24细胞RACGAP1及PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响将circ-RACGAP1敲降质粒转染T24细胞48 h后,采用RIPA试剂裂解。加入适量上样缓冲液煮沸 7 min,行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,低温转膜。加入一抗兔抗RACGAP1(1 ∶3 000)、p-PI3K(1 ∶2 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶3 000)、NF-κB(1 ∶3 000),加入山羊抗兔二抗(1 ∶7 000)。滴加在化学发光试剂,在Bio-rad成像仪中显影,利用Quantity One软件进行灰度值统计分析。

（2015·理综·福建卷）图1为某人工鱼塘食物网及其能量传递示意图（图中数字为能量数值，单位是J·m-2·a-1）。下列叙述正确的是 （ ）

2.1 膀胱癌组织中circ-RACGAP1表达及其临床意义如图1所示,circ-RACGAP1来源于RACGAP1基因的第19、20、21和22外显子,经剪接后形成的环状转录本。经TCGA数据库分析(图2)显示,膀胱癌组织中circ-RACGAP1表达显著高于正常膀胱组织(P<0.01);在膀胱癌组织中circ-RACGAP1表达水平随着膀胱癌患者分期恶性程度的增加而升高(P<0.01),见图3。

2 结果

综上所述，本文结合实例分析了建筑施工项目管理过程中，安全控制的主要策略。通过安全网络体系的构件，相关安全管理制度的完善以及施工现场的安全管理执行，减少了安全事故发生的频次，确保了建筑施工项目的顺利开展。因此，相关工作人员必须重视安全管理工作，努力提高自身的安全管理意识，提高建筑工程施工阶段的安全管理水平，推动我国建筑行业的可持续发展。

图1 circ-RACGAP1的结构示意图

图2 TCGA数据库显示膀胱癌组织中circ-RACGAP1的表达

图3 circ-RACGAP1在不同临床分期膀胱癌患者组织中的表达

2.2 膀胱癌细胞系中circ-RACGAP1的表达水平qPCR检测(图4)显示,与SV-HUC-1细胞相比,circ-RACGAP1在膀胱癌细胞系5637、T24、J82、RT-4、UM-UC-3中均呈高表达(F=39.46,P<0.05),circ-RACGAP1在T24细胞中表达丰度最高(F=17.03,P<0.01),故选择T24细胞为该研究的工具细胞。

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图4 qPCR检测膀胱癌细胞系中circ-RACGAP1的表达

2.4 低表达circ-RACGAP1对T24细胞增殖的影响克隆形成实验(图5)显示,对照组和sh-circ-RACGAP1组T24细胞克隆形成数分别为(66.45±6.44)个和(29.88±5.55)个,sh-circ-RACGAP1组细胞活性明显低于对照组(t=4.30,P<0.01)。

2.3 各组T24细胞中circ-RACGAP1、miR-4324的表达qPCR检测显示,sh-circ-RACGAP1组T24细胞中circ-RACGAP1表达水平较对照组显著下调(t=12.44,P<0.01),而sh-circ-RACGAP1组T24细胞中miR-4324表达水平较对照组显著上调(t=6.91,P<0.01)。

图5 克隆形成实验检测下调circ-RACGAP1对T24细胞增殖的影响

2.5 低表达circ-RACGAP1对T24细胞迁移的影响划痕实验(图6)显示,对照组和sh-circ-RACGAP1组T24细胞迁移率分别为(64.81±4.85)%和(30.58±7.06)%,sh-circ-RACGAP1组细胞迁移能力明显低于对照组(t=4.00,P<0.01)。

图6 划痕实验检测下调circ-RACGAP1对T24细胞迁移的影响

2.6 低表达circ-RACGAP1对T24细胞侵袭的影响Transwell实验(图7)显示,对照组和sh-circ-RACGAP1组细胞侵袭数分别为(104.90±11.75)个和(23.98±7.24)个,sh-circ-RACGAP1组细胞侵袭能力明显低于对照组(t=5.59,P<0.01)。

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图7 Transwell实验检测下调circ-RACGAP1对T24细胞侵袭的影响

2.7 circ-RACGAP1与miR-4324的靶向关系deepBase、Circbank、CircInteractome、circRNABase生物信息学数据库预测(图8A)显示,miR-4324与circ-RACGAP1之间存在潜在的相互结合位点。双荧光素酶报告载体(图8B)实验显示,与miR-NC组相比,miR-4324能够明显下调circ-RACGAP1-WT的荧光素酶活性(t=9.66,P<0.01)。

图8 circ-RACGAP1与miR-4324的靶向关系

2.8 低表达circ-RACGAP1对目的蛋白表达的影响Western blot检测(图9)显示,sh-circ-RACGAP1组T24细胞中RACGAP1蛋白表达较对照组降低(t=14.71,P<0.01),PI3K/AKT信号通路蛋白p-PI3K、p-AKT、NF-κB表达水平均降低(t=8.71,P<0.01;t=5.76,P<0.01;t=15.49,P<0.01)。

图9 Western blot法检测RACGAP1和PI3K/AKT信号通路蛋白表达

3 讨论

circRNA是细胞内转录组的关键组成部分,负责调节各种信号调节通路的转导,影响细胞的黏附、糖酵解、发育等过程[7]。目前已有报道[8]显示,circRNA广泛参与肿瘤细胞内癌基因的激活与抑癌基因的失活,在肿瘤的发病中起到关键作用。相关研究[9]表明,膀胱癌细胞中存在多个circRNA的高表达或低表达,其对膀胱癌的诊疗和复发监测具有重要价值。例如,circ-LONP2 在膀胱癌组织和细胞中表达上调,敲降circ-LONP2表达抑制膀胱癌细胞的活力和侵袭,miR-584-5p是circ-LONP2的下游靶标[10]。例如,膀胱癌组织中的circ-SHPRH表达明显降低,其低水平表达与膀胱癌患者的高级别病理分期、淋巴转移和不良预后呈正相关,沉默 circ-SHPRH可上调miR-942表达,进而增加膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[11]。然而,circ-RACGAP1表达改变与膀胱癌发生、进展的关系尚不明确。该研究表明,circ-RACGAP1在膀胱癌组织和细胞中呈高表达,其表达与膀胱癌患者的临床分期呈正相关,circ-RACGAP1可能与膀胱癌的恶性程度有关。另外,低表达circ-RACGAP1能够抑制膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭能力。该实验结果显示,circ-RACGAP1作为促癌因子在膀胱癌的发生发展中可能发挥重要作用。

近年来大量研究[12]表明,circRNA通过识别下游miRNA,干扰miRNA的功能,以表观遗传调节的方式影响特定基因的表达,从而参与细胞的各种活动。该研究通过deepBase、Circbank、CircInteractome、circRNABase生物信息学数据库预测,miR-4324可能是circ-RACGAP1的靶标。双荧光素酶报告载体实验表明circ-RACGAP1能够直接结合miR-4324。miR-4324是miRNA家族成员,其在包含卵巢癌、食管鳞状细胞癌等在内的肿瘤组织和细胞系中低表达,参与抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭,其低表达预示着肿瘤患者生存率低[13-14]。miR-4324在膀胱癌组织和细胞系中下调,恢复miR-4324表达有助于抑制膀胱癌的进展。qPCR结果显示,低表达circ-RACGAP1可上调miR-4324的表达。因此,circ-RACGAP1通过调节miR-4324表达发挥作用。有研究[15]表明,miR-4324通过抑制膀胱癌细胞中的RACGAP1基因表达和PI3K/AKT信号通路转导发挥抑癌作用。该研究通过Western blot实验显示,低表达circ-RACGAP1后的T24细胞中RACGAP1蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白表达均降低。以上结果表明,circ-RACGAP1通过靶向抑制miR-4324从而调节RACGAP1/PI3K/AKT信号通路。

综上所述,circ-RACGAP1在膀胱癌中高表达,其表达水平与膀胱癌的恶性程度有关。circ-RACGAP1通过靶向抑制miR-4324调控RACGAP1/PI3K/AKT信号通路发挥促癌作用,circ-RACGAP1可能是膀胱癌治疗的新靶点。