罕见地贫分析和检测研究进展

陈华叶 胡俊杰

珠蛋白生成障碍性贫血（以下简称地贫）是全球分布范围最广、累积人群最多的一种单基因隐性遗传病，据报道全球已检测出地贫缺失和突变类型超过350 种，我国境内也检测出超过90种［1-3］。基因检测技术是实现地贫精准检测的金标准，国内常用的地贫基因检测试剂盒一般仅针对中国人群中常见的23 种地贫基因型进行检测，而罕见地贫基因携带者一般表现正常或具有不同程度的贫血等症状，在临床检测中较难发现。本文将介绍目前罕见地贫基因检测的常用方法，并对相关罕见型地贫的分析检测进行经验总结，以期为地贫高发地区的临床检测工作提供参考依据。

1 罕见地贫基因常用检测技术

目前报道中常用的几种检测技术包括：基因测序技术、跨越断裂点法（gap polymerase chain reaction，Gap-PCR）、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等。

1.1 基因测序技术

1.2 Gap-PCR 法

Gap-PCR 法是一种操作简单且对设备要求低的检测方法，使用时根据不同罕见缺失型地贫基因特点，在其缺失片段两端设计一对特异性引物，若发生该片段缺失，则两端引物相互靠近形成有效扩增。经PCR 扩增后可形成特定大小的核酸片段，再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小来判断对应的基因型。Gap-PCR 法可以对--THAL、HKαα、中国型Gγ+（Aγδβ）0 和SEA-HPFH 在内的多种缺失型地贫进行检测，实验条件一般的实验室也可开展，但需要人工进行结果判读，因此要求检测者具有专业的判断能力。

1.3 MLPA 技术

MLPA 技术是一种多重PCR 分析法，可以检测罕见缺失型α 和β 地贫基因。该法检测过程中单次反应可利用多达40 个探针来评估每个DNA序列的相对拷贝数。每个探针对不同的DNA 序列具有特异性（针对目的基因的外显子序列），主要由两个半探针（5′和3′半探针）组成，并包含靶标特异性序列和通用引物序列。反应时两个半探针能够识别连续的靶标特异性序列，并且只有在完全匹配且没有单个缺口的情况下，杂交后才能将两个半探针连接并扩增。此外一个或两个半探针包含填充序列，该填充序列用于在电泳过程中区分探针自身的长度，分辨扩增产物的大小。MLPA 反应的关键点是PCR 不会扩增靶序列，但会扩增连接的探针，通过对扩增产物的分析，从而得出目的片段异常的结果［8］。

2 罕见地贫的表现型分析和检测

2.1 一般罕见缺失型地贫

2.1.1 泰国型α 地贫

泰国型α 地贫（--THAI）是东南亚地区，也是我国南方地区发现较多的α 珠蛋白基因大片段缺失型（缺失的长度约为33.45 kb，涉及两个α-珠蛋白基因以及ζ2 基因）地贫［9-10］。分子机制上受α-珠蛋白大片段缺失的影响，泰国型α 地贫在临床上具有和东南亚型α 地贫相似的表现型，易形成中重型α 地贫。若复合-α3.7 或-α4.2 片段缺失，则产生类似HbH 病表型，若复合东南亚缺失型（--SEA），则可导致水肿胎的发生［11-12］。杜丽等［13］对三个疑似有罕见缺失型地贫或水肿胎生育史的家庭进行家系分析以及产前诊断，成功检测出三个家庭中泰国缺失型α 地贫携带者以及确诊其中两组家庭胎儿基因型为--THAI/αα，表明泰国缺失型α 地中海贫血的准确检测对于遗传咨询和产前诊断具有重要的意义。

疑似--THAI 型主要表现：生育过Bart’S 水肿胎的夫妇，常规α 地贫基因检测显示基因型正常的一方；或生育过类似HbH 病表型的患儿，常规α 地贫基因检测显示一方携带-α3.7 或-α4.2 片段缺失，另外一方基因型正常。上述情况首选Gap-PCR 法进行检测，若结果均排除泰国型α 地贫，则使用MLPA进一步检测是否存在其他罕见缺失型α 地贫。

2.1.2 香港型α 地贫

香港型α 地贫（HKαα）由Wang 等［14］于2005年发现并鉴定，其发生机制主要涉及α 珠蛋白等位基因的罕见重排，形成包含-a3.7 又包含αααanti-4.2 的交叉连接。当-a3.7 和αααanti-4.2 片段位于同一条染色体上时即形成HKαα，而位于两个染色体上时，则形成-a3.7/αααanti-4.2。由于常规地贫基因检测中仅检测--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失，因此HKαα 和-a3.7/αααanti-4.2 可能均被误诊为-a3.7/αα。香港型α 地贫在我国华南地区检出较多，有研究报道广东地区人群检测出-α3.7 阳性样本中HKαα 发生率达2.27%，福建和广西等地检测出HKαα 等位基因发生率分别为 0.33% 和0.07%［15-17］。一般HKαα 的临床症状表现较轻，但HKαα/--SEA 在临床检测上常被误诊为HbH 病，因此需要与-α3.7/αα 进行鉴别诊断，避免导致错误的产前诊断结论和遗传咨询建议。

疑似HKαα 型主要表现：常规地贫基因检测中琼脂糖凝胶电泳结果一般显示“正常带+3.7 带”两条带，其中3.7 条带较弱；或显示“正常带+3.7带+SEA 带”三条带，可设计特异性引物并采用Gap-PCR 法进行验证。

2.1.3 中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫和东南亚缺失型HPFH 地贫

(2) 设置4个处理：0(CK)、100 μmol/ L 褪黑素(MT)、280 μmol/L硝基苯酚(NP)、280 μmol/ L 硝基苯酚 + 100 μmol/L褪黑素(NP + MT)。不同实验组各处理6株水稻幼苗，分别处理5 d后测定水稻幼苗生理指标。褪黑素浓度基于预实验确定，处理前用无水乙醇助溶MT或NP(对照组加等量无水乙醇)，然后加蒸馏水配制成实验所需浓度。

中国人群中最普遍的β 珠蛋白基因簇缺失主要包括中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫和东南亚缺失型HPFH 地贫（SEA-HPFH）［18］。中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫的β 珠蛋白基因的缺失范围约为78.9 kb，包括部分Aγ 球蛋白基因，所有δ 和β 球蛋白基因以及在β 球蛋白基因下游很远的具有调控功能的DNA 序列［19］。中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫携带者一般临床症状较轻，血液学检查呈小细胞低色素性贫血表型，并伴有A γ、G γ 珠蛋白基因的高表达以及HbF 异常升高等特征。国内报道中如韦媛等［20］研究得出广西地区中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫携带率为0.07%，陈剑虹等［21］报道广东惠州地区中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫携带率为0.14%。由于中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫杂合子携带者与其他类型β 地贫携带者结合时可能会生出中重型地贫患儿，因此有必要对高风险家庭进行产前诊断。

东南亚缺失型HPFH 地贫中β 珠蛋白的缺失长度约为27 kb，范围包括β 珠蛋白基因簇的β 基因及其3-HS-1 区域［22］。有研究将SEA-HPFH 地贫和中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫进行比较，结果显示两者MCV、MCH、HbA2 和HbF 的表达水平均存在显著差异［23］。前者的相关血液学参数处于正常范围或临界水平，相对于后者表现出更轻的临床症状，但HbF 具有更高的表达水平。此外SEA-HPFH合并其他β 地贫基因时，临床主要表现为轻度或中度贫血，与中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫有所区别［24］。尽管如此，血液学的差异仍不足以明确区分SEA-HPFH 地贫和中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫，需要通过基因检测进行鉴别。所以对于中国南方地贫高发地区人群，若发现HbF 水平明显增高的病例，在进行常见地贫基因检测外，有必要进行SEA-HPFH地贫和中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫基因检测。

疑似Gγ+（Aγδβ）0 型和SEA-HPFH 型主要表现：血细胞分析为小细胞低色素贫血，血红蛋白电泳结果显示HbF 异常增高，但常规β 地贫基因检测结果显示为正常型；或生育过β 重型地贫患儿，常规β 地贫基因检测显示基因型正常的一方。首选Gap-PCR 法进行检测，若检测结果均排除中国型Gγ+（Aγδβ）0 地贫和东南亚缺失型HPFH 地贫，则使用MLPA 进一步检测是否存在其他罕见缺失型β 地贫。

2.2 其它罕见型地贫

2.2.1 融合基因型

融合基因型产生于珠蛋白基因重组，即同源序列发生非交叉互换，致使珠蛋白基因结构序列增加呈多样性改变。珠蛋白基因结构中ζ2-珠蛋白和ψζ1-珠蛋白基因之间以及α1 珠蛋白和α2 珠蛋白基因之间同源性序列较多，两个ζ-和两个α基因之间易发生同源重组，进而产生融合基因突变［25］。例如Huang 等［26-27］发现的一例地贫融合基因患者（湖南地区）经鉴定是由α 珠蛋白基因的α2段与Ψα1 段序列发生融合所致，合并--SEA 缺失时产生类似HbH 病的症状，相似病例在海南地区也有报道。

疑似融合基因型主要表现：携带者一般表现为静止型地贫症状，血细胞分析可呈现小细胞低色素性贫血。当合并--SEA 缺失时可能产生类似HbH 病的症状（严重时需要输血治疗），但常规地贫基因检测结果为标准型地贫，可用Sanger 测序法进行序列分析。

2.2.2 珠蛋白基因突变或缺失型

随着基因测序技术的发展和推广使用，越来越多的珠蛋白基因突变或缺失被检测并鉴定，例如杨敏和陈扬等［28-29］采用高通量测序技术在湖南和海南地区检测出多种罕见地贫基因型。与融合基因产生机制不同，珠蛋白基因突变或缺失可发生在珠蛋白基因组上任何区域，编码区或非编码区的基因突变通常会导致不同的致病效果。除遗传因素影响外，珠蛋白基因还有自发突变的可能，导致表型正常的父母，其后代因基因突变表现出中重型地贫，因此对罕见地贫家系研究需要更加全面。

疑似珠蛋白基因突变或缺失型主要表现：①排除缺铁性贫血，血细胞分析为小细胞低色素贫血，血红蛋白电泳结果显示HbA2＜2.5 或HbA2＞3.5，但常规地贫基因检测结果显示为正常型；②常规地贫基因检测结果为轻型或标准型地贫，但实际具有中间型或重型地贫表型，伴有严重贫血或需要输血治疗；③常规地贫基因检测显示父母基因型正常或一方正常，但生育出临床表型为中间型或重型地贫患儿（排除非亲缘因素影响）；④血细胞分析正常或异常，血红蛋白电泳出现异常条带，但常规地贫基因检测显示为正常或轻型地贫。上述情况使用Sanger 测序进行珠蛋白测序分析以鉴定患者最终基因型。

3 小结与展望

罕见地贫分析对患者现阶段的治疗和产前诊断都具有重要意义，在临床诊治和实验室检测过程中，为防止罕见地贫的漏诊和误诊，务必要结合具体临床表型及生育史进行综合分析。收集患者相应的临床表型资料如常规地贫基因检测、血细胞分析、血红蛋白电泳、血清铁检测、铁蛋白检测时，若发现基因型和临床表型不相符等情况，应高度怀疑其携带罕见地贫基因，并根据其表型特点选择合适的检测方法以提高罕见地贫基因的检出效率。在未来工作中，地贫高发地区根据本地实际情况，可增加地贫基因突变检测类型，有条件的可以为受检者一次性提供α 和β 地贫基因的高通量测序检测。同时尽可能建立以高通量测序技术为主导的地贫检测模式，这对充分发掘地贫遗传资源并促进全面地贫防控具有重要作用。