重症龋患儿唾液TRPA1、NLRP3 的表达水平及临床意义

李姣 郭战坤 魏鹏 李雪莉 李燕

龋齿是儿童常见的口腔疾病，表现为牙体组织进行性破坏并产生龋洞。龋齿的发生和进展是多因素共同作用的结果，不及时干预会导致侵蚀范围扩大、多个牙齿多个牙面同时受累，最终形成重症龋。重症龋严重影响患儿的学习和生活，也增加远期牙龈炎、牙髓炎等疾病的发生风险［1-2］。因此，深入研究重症龋的相关生物学因素，对早期识别疾病发生风险、及时进行干预具有重要意义。相关的基础研究结果显示，瞬时电位受体离子通道（transient receptor potential，TRP）家族中的TRPA1 以及Nod样受体（Nod like receptor，NLR）家族中的NLRP3参与龋齿的进展［3-4］。为深入认识TRPA1、NLRP3在重症龋中的作用，本研究对重症龋患儿唾液TRPA1、NLRP3 的表达水平及临床意义进行分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2021 年1 月至2022 年6 月期间在保定市妇幼保健院接受治疗的142 例龋齿患儿作为研究对象，纳入标准：①符合龋齿诊断标准［5］；②年龄3～7 岁；③未接受过龋齿相关治疗；④留取唾液标本；⑤临床资料完整。排除标准：①合并全身性疾病或先天性疾病；②佩戴牙齿矫正器的儿童；③不能配合本研究。根据龋齿严重程度［5］将142 例龋齿患儿分为重症组（n=46）和非重症组（n=96）。另取同期体检的70 名无龋齿健康儿童作为对照组（n=70）。三组间一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究获得医院伦理委员会批准，取得受试儿童监护人知情同意。

表1 三组一般资料比较（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

表1 三组一般资料比较（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

1.2 龋齿严重程度评价标准

评价口腔中发生龋病的牙数或者牙面数，计算龋失补指数（decayed-mising-filled teeth，DMFT）［5］=龋坏牙+失牙数+因龋填 充牙齿，DMFT=0 为无龋 齿、DMFT＜4 为非重 症龋齿、DMFT≥4 为重症龋齿。

1.3 唾液样本收集及检测

收集唾液前所有受试者进行漱口、清洁口腔，而后将唾液约100 μL 收集于干燥无菌的试管内，常温下按照速度3 500 r/min、半径10 cm 离心20 min，取上清液用于TRPA1 和NLRP3 检测。采用放射免疫法检测TRPA1 和NLRP3 的蛋白表达水平，所有实验均由同一名人员按照放射免疫法试剂盒（型号F00014、F00042，上海西唐生物科技公司）说明书完成。

1.4 龋齿患儿临床资料收集

根据龋齿患儿的病历信息收集以下资料：年龄、性别、吃甜食频率、开始刷牙时间、每天刷牙次数、使用含氟牙膏、家长监督刷牙，吃甜食频率分为＜2 次/天和≥2 次/天，开始刷牙年龄分为＜3 岁和≥3 岁，每天刷牙频率分为＜2 次和≥2 次，使用含氟牙膏和家长监督刷牙均分为否或是。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用卡方检验；采用Pearson 检验进行相关性分析；采用受试者工作特性曲线（ROC）分析唾液TRPA1、NLRP3 对重症龋的诊断价值；采用多因素logistic 逐步回归分析重症龋的影响因素。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组唾液TRPA1、NLRP3 表达水平比较

三组唾液TRPA1、NLRP3 表达水平比较为：重症组＞非重症组＞对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 三组唾液TRPA1、NLRP3 表达水平比较［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

表2 三组唾液TRPA1、NLRP3 表达水平比较［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

注：与对照组比较，aP＜0.05；与非重症组比较，bP＜0.05。

2.2 龋齿患儿唾液TRPA1、NLRP3 表达水平与DMFT 的相关性

重症组龋齿患儿唾液TRPA1、NLRP3 的表达水平与DMFT 呈正相关（r=0.351、0.384，P＜0.05）；非重症组龋齿患儿唾液TRPA1、NLRP3 的表达水平与DMFT 无明显相关性（P＞0.05）。

2.3 唾液TRPA1、NLRP3 表达水平对重症龋的诊断价值

以龋齿患儿是否重症作为状态变量绘制ROC曲线，唾液TRPA1、NLRP3 表达水平诊断重症龋的曲线下面积分别为0.850、0.864，两项指标诊断重症龋的截断值分别为1.41 pg/mL、2.54 pg/mL，灵敏度分别为76.09%、89.13%，特异度分别为83.33%、82.29%。见表3、图1。

图1 ROC 曲线Fig. 1 ROC curve

表3 唾液TRPA1、NLRP3 表达水平诊断重症龋的ROC 曲线分析Table 3 ROC curve analysis of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva for diagnosis of severe caries

2.4 发生重症龋的单因素分析

重症组与非重症组患儿的年龄、性别、开始刷牙年龄、使用含氟牙膏比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；重症组患儿吃甜食频率≥2 次/天的比例及唾液TRPA1、NLRP3 表达水平高于非重症组，刷牙频率≥2 次/天、家长监督刷牙比例低于非重症组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 发生重症龋的单因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

表4 发生重症龋的单因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

2.5 发生重症龋的多因素logistic 回归分析

以重症龋为因变量（非重症龋=0、重症龋=1），以2.4 单因素分析中有统计学意义的因素作为自变量，采用逐步发进行多因素logistic 回归分析，吃甜食频率≥2 次/天、唾液TRPA1 表达水平≥1.41 pg/mL、唾液NLRP3 表达水平≥2.54 pg/mL 是发生重症龋的危险因素，刷牙频率≥2 次/天、家长监督刷牙是发生重症龋的保护因素（P＜0.05）。见表5。

表5 发生重症龋的多因素logistic 回归分析Table 5 Multivariate logistic regression analysis of severe caries

3 讨论

儿童龋齿是影响儿童口腔健康的常见疾病，其是在多因素作用下出现乳牙牙体组织无机物脱矿、硬组织崩解并进行性破坏而产生龋洞。龋齿形成后如不能及时对导致龋齿形成的因素进行干预，会导致牙体组织破坏范围扩大、多个牙齿及多个牙面同时受累，进而形成重症龋。重症龋的临床危害大，不仅直接影响咀嚼功能、不利于恒牙和颌面发育，还会增加远期牙龈炎、牙髓炎的发生风险，严重影响患儿身心健康［6-7］。目前，对龋齿特别是重症龋分子生物学机制的认识不足极大地限制了疾病的早期识别及靶向治疗。

乳牙牙体矿化程度低、硬组织薄、抗酸力弱是导致龋齿形成的内在因素，儿童喜食甜食、刷牙习惯不正确或效果不佳等是导致龋齿形成的外在因素，在两方面因素共同作用下，致龋微生物大量繁殖、酸性代谢产物大量形成并最终导致牙体组织破坏，产生龋洞［8-9］。国内外重症龋相关的临床研究结果显示：吃甜食频率高、刷牙次数不足、家长口腔健康意识不足均会增加重症龋的风险［10-12］。本研究中，吃甜食频率≥2 次/天是发生重症龋的危险因素，而刷牙频率≥2 次/天、家长监督刷牙是发生重症龋的保护因素，与既往重症龋相关因素的研究结果［10-12］基本吻合。以上研究结果主要反映重症龋发病的外在因素，未能从内在因素认识重症龋的发病。

致龋微生物大量繁殖是导致龋齿形成的重要生物学因素，致龋微生物能够作为上游生物学信号引起下游信号通路活化，进而导致炎症反应、氧化应激反应激活以及免疫紊乱，最终造成牙体组织损害［13-14］。TRP 家族和NLR 家族在识别微生物、调控生物信号转导中发挥重要作用。TRPA1 和TRPV1 是TRP 家族的重要成员，一项基础研究［3］证实TRPA1 在龋齿形成中起促进作用、而TRPV1 不发挥作用；NLRP1、NLRP3、NLRC4 是NLR 家族的重要成员，一项基础研究［15］证实NLRP1、NLRC4不参与龋齿形成，另一项基础研究证实［4］NLRP3参与龋齿形成。本研究中，重症龋和非重症龋患儿唾液中TRPA1 和NLRP3 的表达水平均较对照组增加且重症龋患儿中上述表达增加更显著，与既往相关基础研究的结果一致［4，15］，提示TRPA1和NLRP3 高表达与重症龋的发病相关。

TRPA1 为钙离子依赖性通道，微生物感染后炎症介质和氧化应激产物的释放能够刺激TRPA1 表达，进而在牙组织、关节软骨组织等损伤中起促进或加重作用［16］。NLRP3 为模式识别受体，识别微生物等病原模式分子后使下游炎症小体活化，进而激活炎症反应及细胞焦亡，进而在牙组织、心肌组织等损伤中起促进或加重作用［17］。本研究结果提示TRPA1 和NLRP3 高表达可能通过激活炎症反应、氧化应激反应等方式导致重症龋的进展。进一步通过ROC 曲线分析及影响因素分析可知：唾液中TRPA1 和NLRP3 的表达水平对重症龋具有诊断价值，TRPA1 和NLRP3 高表达是发生重症龋的危险因素。

综上所述，重症龋患儿唾液中TRPA1、NLRP3表达增加，重症龋发病可能与TRPA1、NLRP3 表达增加介导的生物学效应相关，这可为今后临床重症龋新的防治靶点研发提供依据。