小麦白粉菌BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的克隆及在调控无性繁殖中的作用

曾凡松 翟亚美 袁斌 龚双军 向礼波 薛敏峰 阙亚伟 史文琦 郑磊 张强 杨立军 喻大昭

摘要：为了明晰小麦白粉菌BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的序列特点及它们在白粉菌产孢过程中的表达动态，为解析velvet蛋白在调控白粉菌无性繁殖中的作用提供理论依据，采用基于RNA-seq数据的克隆测序技术获得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的CDS序列，用生物信息学方法分析它们编码的蛋白质序列特征和空间结构，用RT-qPCR监测它们在白粉菌分生孢子形成时期的表达模式。结果表明，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的ORF长度依次为1470、1341、1143 bp，分别编码489、446、380个氨基酸，分子量在54.0～48.0 ku，属于碱性、亲水性、热不稳定蛋白质，均含有核定位信号，不含跨膜螺旋和信号肽，空间结构呈现出近球形。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA分别与其他真菌来源的VosA、VelB、BrlA蛋白具有同源性，且与白粉菌同源蛋白具有更近的亲缘关系，氨基酸序列在白粉菌自然群体中均高度保守。BgtVosA、BgtVelB属于典型的velvet蛋白家族成员，可能通过分子互作形成复合物，但其结构与构巢曲霉同源蛋白复合物存在明显差异。在小麦白粉菌无性繁殖阶段，BgtVosA、BgtVelB基因均显著上调（P<0.01），BgtBrlA表达水平没有显著变化（P>0.05）。 DNA结合区域分析推测BgtVosA-BgtVelB复合物不能靶向BgtBrlA启动子，调控其BgtBrlA的表达。BgtVosA、BgtVelB基因在调控白粉菌无性生殖中起重要作用。

关键词：小麦白粉菌；Velvet蛋白；BrlA基因；无性产孢；表达分析

中图分类号：S435.121.4+6文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）16-0026-09

收稿日期：2022-11-23

基金项目：国家小麦产业技术体系建设专项（编号：CARS-3-1-2）。

作者简介：曾凡松（1980—），男，湖北宜昌人，博士，副研究员，主要从事小麦病害防控研究。E-mail：zengfansong2005@126.com。

通信作者：杨立军，博士，研究员，主要从事小麦病害防控研究。E-mail：Yanglijun1993@163.com。

小麦白粉病是由禾谷类白粉菌小麦专化型（Blumeria graminis f. sp. tritici，Bgt）引起的重要病害。白粉病降低小麦的产量和品质，在我国常年发生面积约700万hm²，对小麦生产造成了严重威胁^［1］。禾谷类白粉菌只能在活的寄主上生活，可通过有性生殖和无性生殖繁衍后代，其中有性生殖每年只发生1次；而无性生殖可在1个生长季节发生很多次，产生的分生孢子不仅是无性世代的繁殖体，而且是病害流行的主要侵染源^［2］。分生孢子落在小麦叶片上1 d后侵入寄主表皮细胞，2 d后形成成熟的吸器，从寄主细胞中不断汲取营养物质，3 d后形成大量的营养菌丝，4 d后进入无性生殖阶段，菌丝上开始形成足细胞，5 d后开始形成分生孢子梗，不断分化出分生孢子，在风力的作用下扩散传播，导致病害迅速扩散^［3］。解析白粉菌产孢相关基因的功能，有助于揭示白粉菌无性繁殖的分子机制，为白粉病的流行和防控提供理论依据。关于丝状真菌产孢遗传机制的研究始于对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究。BrlA基因编码1个C₂H₂—锌指转录因子，它能够激活AbaA、WetA基因的表达，这3个基因组成的BrlA-AbaA-WetA途径在构巢曲霉无性产孢过程中起核心调控作用^［4］。Velvet家族蛋白是丝状真菌特有的蛋白，它们具有Velvet结构域，参与真菌无性、有性发育过程的调控和次生代谢产物的合成，其成员包括VosA（viability of spores A）、VeA （velvet）、VelB（velvet like B）、VelC（velvet like C）、VelD（velvet like D）^［5-6］。Velvet蛋白可在BrlA-AbaA-WetA途径下游起调控作用，其中VosA能够与VelB形成复合物，结合到BrlA的启动子区域，反馈抑制BrlA的表达，从而影响分生孢子的数量和成熟^［7-8］。VosA、VelB能够直接或间接地调节异源G蛋白信号转导途径和促分裂原蛋白激酶信号途径相关基因，影响真菌无性生殖、初生代谢和次生代谢^［9-10］。国内外关于白粉菌velvet蛋白的研究還未见报道。从已发表的小麦白粉菌基因组中找到了3个含有velvet结构域的蛋白，NCBI登录号分别为：EPQ65573.1、EPQ63747.1、EPQ67732.1^［11］。

白粉菌无法在人工培养基上生长，只能在活的寄主上存活，因而很难对其进行遗传转化，基因功能研究进展速度偏慢。本研究对小麦白粉菌2个velvet蛋白BgtVosA、BgtVelB以及调控因子BgtBrlA进行了氨基酸序列分析、功能注释、结构预测和变异位点检测，对这些基因在小麦白粉菌分生孢子形成过程中的表达谱进行了监测，旨在为揭示白粉菌无性生殖调控的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的小麦白粉菌菌株Bgt21-2来自江苏省盐城市^［12］。培养白粉菌的小麦材料为感病品种Chancellor。种植小麦的土壤为含有水溶肥（山东金正大生态工程集团股份有限公司）的营养土，白粉菌的接种、扩繁参照Yang等的方法^［3］。菌株在Chancellor离体叶段上进行扩繁，每12 d扩繁1次。

1.2 基因克隆

以构巢曲霉AnVosA、AnVelB（NCBI登录号分别为ABI51618.1、ABQ17967.1）和烟曲霉（A. fumigatus）AfBrlA蛋白质序列（NCBI登录号 XP_753026.1）为查询序列，在已发表的参考菌株 96224蛋白质数据库^［11］中进行BLASTp比对，获得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的候选蛋白。根据菌株Bgt21-2分生孢子形成阶段转录组测序的reads比对参考基因组后的数据^［13］，获取覆盖3个基因ORF的cDNA序列。采用Primer Premier 6.0软件从ORF上游和下游设计引物，送武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

采用醋酸纤维素包埋法^［14］将接种5 d后的小麦叶片表面的菌丝体剥离，液氮速冻后保存备用。采用Trizol试剂盒和PrimeScript^TM反转录试剂盒（大连宝生物科技有限公司）提取总RNA和合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。25 μL反应体系包含1 μL cDNA，2.5 μL 10×ExTaq PCR buffer，1.25 μL 50 mmol/L Mg²⁺，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，上下游引物各0.5  μL，0.25 μL ExTaq酶（大连宝生物科技有限公司），补ddH₂O至25 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，40个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经凝胶回收后连接到T-vector pMD^TM19，送武汉天一辉远生物科技有限公司测序。为检测目的基因DNA序列变异，采用CTAB法提取菌株分生孢子样品中的基因组DNA^［15］。用相同的方法进行 PCR 扩增、产物连接和序列测定。

1.3 基因序列特征分析

采用DNAMAN v6.0软件和NCBI ORF finder工具对基因编码区进行序列分析。采用ExPASy-ProtParam和ExPASy-Scale工具分析蛋白质氨基酸的理化性质，包括分子量、理论等电点、脂肪指数和亲水性指数^［16］。采用SinalP v5.0、NLStradamus 和TMHMM v2.0等软件预测蛋白质的信号肽、核定位信号和跨膜区^［17-19］。采用MEME Suite v5.5.0 进行motif分析。采用I-TASSER在线工具计算 B-因子（B-factor），预测蛋白质二级结构和三级结构^［20］。采用ZDOCK Server（https：//zdock.umassmed.edu/）进行蛋白之间的分子对接^［21］。

1.4 系统发育树的构建

将目标蛋白质序列在NCBI nr蛋白质数据库中进行BLASTp比对，搜索并下载同源序列。采用MEGA v6.0软件和邻接法（Neighbor-Joining method）进行序列比对和系统发育树构建^［22］，并进行bootstrap 1 000次重复检验。

1.5 表达谱分析

在接种菌株Bgt21-2后3 dpi（菌丝生长期）、4 dpi （足细胞发育期）和5 dpi（分生孢子梗发育期），取感染的小麦离体叶段进行台盼蓝染色，显微观察和拍照。采用醋酸纤维素包埋法收集3个时间点的叶表面菌体，每个时间点样品重复3次。总RNA的提取和cDNA合成方法同“1.2”节。根据“1.2”节方法克隆的目标基因的ORF序列，设计引物送武汉天一辉远生物科技有限公司合成。PCR反应体系采用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix-Universal Kit （吐露港生物科技有限公司）配制。PCR反应参照Hacquard等的方法^［14］执行。PCR反应在ABI 7500 real-time PCR仪上完成，每个反应重复3次。采用2^-ΔΔC_T方法和SPSS v26.0软件计算基因相对表达量和统计分析^［23］。

2 结果与分析

2.1 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的克隆

通过BLASTp比对从菌株96224基因组中获得了候选BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白序列，NCBI登录号分别为EPQ63747.1、EPQ65573.1、EPQ63980.1。根据菌株Bgt21-2转录组reads覆盖参考基因组区段，从非编码区设计了特异性PCR引物对（表1）。 以5dpi菌体样品总RNA反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，分别获得了覆盖BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA等3个基因完整ORF区域的cDNA序列，包含完整的ORF区域长度，分别为1 470、1 341、1 143 bp，编码489、446、380个氨基酸（图1），其中BgtVosA、BgtVelB各含有3、4個内含子，BgtBrlA不含内含子（图2）。

2.2 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的理化性质、序列特征和功能注释

BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA这3个基因编码的蛋白质的分子量分别为54.6、47.8、43.7 ku，等电点为7.2～8.0，均属于偏碱性蛋白质。这些蛋白亲水指数（GRAVY）为-0.93～-0.50，脂肪指数为42.0～59.0，提示它们都是亲水性、热不稳定蛋白。3个蛋白均不含跨膜区和信号肽（表2）。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的核定位信号分别位于第191～204位氨基酸（RVRKEQNRTLIRKR）、第431～437位氨基酸（RKDAAKG）、第325～358位氨基酸（DKGGPDRPNRRTQYFKDAGKIIKAMSRRGGKLFS）。BgtVosA、BgtVelB具有典型的velvet结构域（Pfam数据库：PF11754.11；Interpro数据库：IPR037525），属于velvet蛋白。BgtBrlA蛋白是1个C₂H₂型锌指蛋白（Pfam数据库：PF02200.19；PF13465.9；Interpro数据库：IPR013087），具有结合DNA和调控转录的功能，推测为1个转录因子（图2）。

2.3 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的系统进化分析

选择同源蛋白质序列分别构建BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的系统进化树（图3）。BgtVosA与来自白粉菌的同源蛋白能聚到1个较大的分支中。小麦白粉菌、小黑麦白粉菌、大麦白粉菌等禾谷类白粉菌的同源蛋白之间的亲缘关系最近，处在同1个小分支中。它们与来自拟兰芥白粉菌等双子叶植物上白粉菌的同源蛋白也具有较近的亲缘关系。BgtVelB、BgtBrlA呈现出类似的结果，但不同的是，来自白粉菌的同源蛋白与来自腐生生活真菌的同源蛋白分别处在彼此独立的分支中，表现出更远的进化距离。

同源蛋白的模体分析表明，从BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的同源蛋白中分别找到了10、6、5个保守的模体。23个VosA同源蛋白均含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它们的注释为velvet 蛋白结构域。在25个VelB同源蛋白序列中发现了4个保守的模体，分别为Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它們均为velvet蛋白结构域。18个BrlA同源蛋白中高度保守的模体包括Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5，其中Motif 1、Motif 2为锌指结构域，Motif 5为核定位信号序列（图3）。

2.4 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白二级和三级结构分析

BgtVosA的二级结构含有4个α螺旋和9个延伸链，分布在氨基酸序列的N端，84.5%的序列为无规则卷曲（图4-A），B-因子在N端富含二级结构的区域呈现频繁的起伏变化，说明BgtVosA该区域在空间上具有明显的刚性和柔性相结合的特性。在BgtVelB序列中只发现了1个α螺旋和6个延伸链，超过90%的序列为无规则卷曲（图4-B），在C端第350～400位氨基酸区域，B因子具有明显的增加，说明该区域有利于蛋白折叠时塑造更加灵活的空间结构。BgtBrlA蛋白含有相对较多的α螺旋（占13.2%），而延伸链只占1.6%。

基于二级结构，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的三级结构均呈现出近球形，属于球形蛋白（图5）。BgtVosA、BgtVelB分别与PDB数据库中来自构巢曲霉的AnVosA-AnVelB 复合物（PDB登录号：4n6r）的A链（VosA，4n6r.1.A）、B 链（VelB，4n6r.1.B）能够较好地匹配，校正的Z-score分别达到9.07、8.60（表3）。其中BgtVosA、BgtVelB与A链和B链氨基酸序列的一致性分别为54.9%、50.3%，提示BgtVosA与BgtVelB可能存在类似的互作。进一步通过ZDOCKER在线服务器对BgtVosA、BgtVelB进行分子对接，结果发现它们可以在空间上接近，形成1个复合物，互作的区域位于BgtVosA蛋白靠近N端的延伸链区、BgtVelB蛋白靠近C端的延伸链，与构巢曲霉的复合物存在明显差异（图5-D）。

2.5 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麦白粉菌自然群体中的变异

采用PCR产物测序的方法，对来自江苏等省份白粉菌的BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因序列进行了测定，序列比对结果表明，在BgtVosA基因ORF中，有3个菌株的第1 234位碱基发生了点突变，导致第412位氨基酸有甘氨酸（G）突变为丝氨酸（S），属于非错义突变。突变菌株有2个来自甘肃省，1个来自河北省（表4）。突变位点不在velvet功能结构域内。在BgtVelB、BgtBrlA基因序列中未检测到突变。

2.6 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麦白粉菌无性产孢阶段的表达谱分析

基因表达量检测结果表明，与叶表面菌丝生长阶段（3 dpi）相比，BgtVosA、BgtVelB在4、5 dpi均呈现显著上调表达（P<0.01），其中BgtVosA持续上调表达，BgtVelB在产孢阶段维持较高的表达水平。BgtBrlA基因水平在整个过程中没有表现出显著的差异（图6）。这些结果说明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌无性生殖过程中起重要调控作用，BgtBrlA可能起基础作用。根据Ahmed等的报道，构巢曲霉AnVosA-AnVelB复合物能够特异性地结合到BrlA基因启动子区域的CCGCGG的基序^［8，10］。采用DNAMAN软件在BgtBrlA 5′非翻译区搜索2个基序，结果未发现相关DNA序列，作者推测BgtVosA-BgtVelB复合物可能不是通过类似的方式调控BgtBrlA的基因表达。

3 讨论

Velvet蛋白普遍存在于植物病原真菌中，例如玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）^［24-26］。它们均含有同源的velvet结构域序列，与其他已知蛋白缺乏相似性，这些序列具有DNA结合能力^［27］。在本研究中，小麦白粉菌BgtVosA、BgtVelB的序列特征、功能模体分析表明，它们均含velvet结构域， 说明它们能够与特定DNA结合。而且，它们具有核定位信号，没有跨膜螺旋和信号肽，提示可能在细胞核中发挥作用，调控其他基因的表达。对构巢曲霉AnVosA、AnVelB蛋白的靶向基因启动子序列分析结果表明，它们具有十分相似的DNA结合序列（5′-CCXTGG-3′、 5′-CCXXGG-3′），靶向包括BrlA在内的166个参与无性繁殖调控的基因^［10］。而且，AnVosA-AnVelB复合物能够抑制AnBrlA的表达，阻止构巢曲霉无性生殖的开始^［4］。BgtVosA、BgtVelB在氨基酸序列和空间结构上均分别与AnVosA、AnVelB蛋白存在显著的相似性，经预测能够互作形成复合物，提示它们可能靶向相似的基因，例如AnBrlA。但是，BgtVosA-BgtVelB复合物在空间结构上与AnVosA-AnVelB复合物存在明显差异^［8］，而且在BgtBrlA基因启动子区域并未找到类似的序列，BgtBrlA基因也不随BgtVosA、BgtVelB基因的变化而变化，推测BgtVosA-BgtVelB复合物不调控BgtBrlA的表达。AnVosA-AnVelB复合物还能够靶向构巢曲霉vidD、McrA等生长发育相关基因的启动子并调控它们的表达^［28-29］。对BgtVosA、BgtVelB及其复合物开展蛋白表达、空间结构、与DNA互作分析将有助于发现它们调控的基因。

系统进化分析表明，BgtVosA、BgtVelB与其他真菌的同源蛋白具有保守的基序，可能具有相对保守的功能。BgtVosA的序列在不同白粉菌菌株中是高度保守的，在velvet结构域没有发现突变，BgtVelB的序列则完全一致。而且，BgtVosA、BgtVelB在小麦白粉菌分生孢子形成过程中显著上调。上述结果说明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌的无性生殖调控中起重要作用，在白粉菌进化过程中一直得以保留。Velvet蛋白家族成员可通过自身形成二聚体，彼此形成二聚体或者与其他非velvet蛋白（如LeaA）形成复合物，通过反馈抑制参与曲霉无性生殖的调控^［4］。然而，BgtVosA、BgtVelB的空间结构主要以无规则卷曲为主，部分区域B-因子数值较高，它们的互作模型具有较强的可缩性，可形成不同结构的复合物，导致它们参与的调控网络可能与构巢曲霉等真菌存在差异。下一步研究将对3个基因开展沉默和表型分析、轉录组测序和蛋白-DNA互作等研究，有望进一步解析它们的调控网络。

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