痹祺胶囊对类风湿性关节炎关键靶点的调节作用

韩彦琪 ，宋紫腾 ，姚鹏飞 ，张祥麒，许 浚 ，王 磊，赵专友 ，张铁军 *，刘昌孝 *

1.天津药物研究院 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300462

2.天津药物研究院 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室，天津 300462

3.天津药物研究院 药物成药性评价与系统转化全国重点实验室，天津 300462

4.天津中医药大学，天津 301617

5.天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300112

6.津药达仁堂集团股份有限公司，天津 300193

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、系统性、炎症性自身免疫性疾病，属于中医“痹病（证）”范畴。主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎。RA 的基本病理特征是滑膜炎症，由于关节滑膜细胞增生，形成血管翳，进而侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌键等，造成关节软骨、骨关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，严重时甚至可致残疾，对患者的生活造成不利影响。现代医学表明，RA 患者伴有炎症、血瘀、软骨损伤等症状[1]。

痹祺胶囊由马钱子、地龙、党参、茯苓、白术、川芎、丹参、三七、牛膝、甘草10 味药材组成，具有益气养血、祛风除湿、活血止痛的功效。临床研究表明，痹祺胶囊对RA 具有显著的治疗效果[2-5]，但对其作用机制的研究还不全面。为探究痹祺胶囊的关键作用靶点并明晰其药效物质基础，本研究在前期化学物质组、血中移行成分[6]及网络药理学研究的基础上并结合相关文献，选取了10 味药材中各结构类型的主要代表性成分共19 个化合物为研究对象，同时以与抑制滑膜炎症相关的受体[环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、趋化因子受体4（C-C chemokine receptor type 4，CCR4）]，与活血相关的受体[凝血酶、磷酸二酯酶（ cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase，PDE3A）、肾上腺素受体 α1（alpha-1A adrenergic receptor，ADRA1A）]，与抑制血管翳生成相关的受体[血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor 2，

VEGFR2/KDR）]，以及与抑制基质降解相关的受体基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）9 个关键靶点为研究载体，通过运用胞内钙离子荧光检测和酶抑制剂检测技术评价痹祺胶囊中19 个主要单体成分对9 个关键靶点的抑制活性。

1 材料

1.1 药品与试剂

QUANTI-Blue™检测试剂（批号QBS-4222）、丙磺舒（批号2157171）购自美国InvivoGen 公司；细胞活力荧光检测试剂盒（批号0000424721）购自美国Promega 公司；G418（批号2121442）购自美国Gibco 公司；星形孢菌素（批号S142105）购自Selleckchem 公司；Fluo-4 Direct 试剂盒（批号2325989）、HBSS（批号2193007）、HEPES（批号2192573）购自美国Invitrogen 公司；人凝血酶（批号 F1900752 ）、BIOPHEN CS-11(38) （ 批号F2000197）购自HYPHEN BioMed 公司；KDR（批号07CBS-0540）购自Carna 公司；Peptide FAM-P22 GL（批号P180116-MJ112393）购自Biochem 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批号WXBD820V4）、阿加曲班（批号141396-28-3）、肾上腺素（批号 WXBD1853V）、WB4101（批号117H46492）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批号 987-65-5）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号474382）、EDTA（批号60-00-4）购自美国Sigma 公司；FLIPR®Calcium 4 assay kit（批号3233461）、IMAP FP IPP Explorer Kit（批号MD167386）、羧基荧光素标记的环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP，批号2873747）购自Molecular Devices 公司；PDE3A（批号110802HEGE）购自BPS 公司；Dipyridamole（批号15979）购自美国MCE 公司；人TARC/CCL17（批号M2106001）购自Genscrip 公司；C-021（批号2A/249015）购自Tocris 公司；OptiPlate TM-384黑色微孔板（批号 8240-18341）购自美国PerkinElmer 公司；COX-2 抑制剂检测试剂盒（批号041421210419）购自上海碧云天生物技术有限公司；NOS 抑制剂检测试剂盒（批号7G26K02080）购自BioVision 公司；MMP-3 抑制剂检测试剂盒（批号GR3381906-1）购自英国Abcam 公司；19 个单体化合物信息见表1。

表1 19 个单体化合物信息Table 1 Information of 19 monomer compounds

1.2 细胞

HEK-Dual™ TNF-α 细胞、稳定表达CCR4 受体的HEK293 细胞购自上海药明康德新药开发有限公司；稳定表达ADRA1A 受体的CHO-K1 细胞购自上海睿智化学研究有限公司。

1.3 仪器

FlexStation 3 型多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；TC20 型细胞计数仪（美国Bio-Rad公司）；CKX41SF 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Echo550 型超声波纳升液体处理系统（美国Labcyte 公司）；EZ Reader II 型激酶检测仪/微流控系统（美国Perkin Elmer 公司）；AllegraTM25R 型离心机（美国Beckman 公司）；3111 型CO2培养箱（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 抑制滑膜炎症相关靶点抑制实验

2.1.1 COX-2 抑制活性实验 取适量待测样品，用DMSO 将化合物配制成0.2、2 mmol/L 检测浓度的溶液（终浓度为10、100 μmol/L）。以塞来昔布为阳性对照，以100 μmol/L 的起始浓度（终浓度5 μmol/L），在DMSO 中5 倍连续梯度稀释8 个点。按照试剂盒说明书进行操作，计算每个样品的抑制率。

抑制率＝(RFU100%酶活性对照－RFU样品)/(RFU100%酶活性对照－RFU空白对照)

2.1.2 NOS 抑制活性实验 取适量待测样品，用缓冲液将化合物配制成40、400 μmol/L（终浓度为10、100 μmol/L ），以二苯基氯化碘盐（diphenyleneiodonium chloride，DPI）为阳性对照，以200 μmol/L 的起始浓度（终浓度50 μmol/L），用缓冲液5 倍连续梯度稀释8 个点。按照试剂盒说明书进行操作，计算抑制率。

2.1.3 NF-κB 拮抗实验 将10 μL 终浓度为10、100 μmol/L 的待测样品加入到96 孔板，参考化合物肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）最高质量浓度为1000 ng/mL，3 倍梯度，共9 个质量浓度，阴性对照孔（NC）和阳性对照孔（PC）每孔加入10 μL 培养基（DMSO 终体积分数为0.5%）。然后按照5×104个/孔将80 μL HEK-Dual™ TNF-α细胞接种于已加好待测样品的96 孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱共孵育2 h 后，PC 组每孔加入10 μL培养基，其余组每孔加入10 μL 200 ng/mL 的TNFα（终质量浓度20 ng/mL），离心后在37 ℃、5% CO2培养箱共孵育24 h。每孔取20 μL 细胞上清，加入含有180 μL QUANTI-Blue™试剂的实验板中，37 ℃孵育1 h 后，用多功能酶标仪SpectraMax M2e 检测650 nm 的吸光度（A）值。按照Celltiter-Glo 说明书方法操作，化学发光信号（RLU）用多功能酶标仪synergy2 检测。

化合物抑制活性＝(A化合物－ANC)/(APC－ANC)

细胞活性＝RLU化合物/RLUPC

2.1.4 CCR4 拮抗实验 稳定表达CCR4 受体的HEK293 细胞（DMEM＋10%胎牛血清、300 μg/mL G418、2 μg/mL BS），以1×106个/mL 接种于多聚赖氨酸包被的384 孔板，5% CO2、37 ℃培养箱孵育过夜。

（1）80%有效浓度（80% effective concentration，EC80）检测：去除细胞板中培养液，每孔加入20 μL检测缓冲液（20 mmol/L HEPES、1×HBSS、0.5%BSA），再加入20 μL Fluo-4 检测试剂，37 ℃孵育50 min，室温静置10 min。将激动剂人TARC/CCL17用检测缓冲液3 倍稀释成10 个浓度并转移到EC80检测化合物板中，每孔30 μL（起始浓度为1μmol/L）。启动仪器，从化合物板中转移10 μL 激动剂到细胞板中，读数，计算EC80。

（2）化合物拮抗活性检测：将19 个化合物用DMSO 稀释为2 mmol/L 溶液（终浓度为10、100 mmol/L），将阳性拮抗剂C-021 进行3 倍稀释成10个浓度（起始终浓度50 mmol/L），用Echo 分别转移900 nL 到CCR4 化合物板中，每孔加入30 mL 检测缓冲液。去除细胞板中培养液，每孔加入20 mL检测缓冲液，然后再加入20 mL Fluo-4 检测试剂。用FLIPR 转移10 mL 化合物至细胞板中，37 ℃孵育50 min，室温静置10 min。配制CCR4 的EC80并加入到EC80板中，每孔30 mL。从EC80板中转移10 mL 化合物到细胞板中，读数，计算各化合物抑制率。

抑制率＝100－(RLU－LC)/(DMSO－LC)

RLU 为相对A值，1 至Maximum allowed 的读值；DMSO为DMSO 组荧光信号平均值；LC 为拮抗剂最高浓度点荧光信号平均值

2.2 抑制血管翳形成相关靶点抑制实验

将FAM 标记的底物多肽和ATP 加入1 倍激酶缓冲液[（50 mmol/L HEPES、pH 7.5、0.001 5%聚氧乙烯月桂醚-35（Brij-35）]，形成2.5 倍底物溶液。用DMSO 配制19 个待测化合物储液，用激酶缓冲液稀释成5 倍检测浓度（终浓度为10、100 μmol/L）。阳性抑制剂星形孢菌素最高检测浓度为1 μmol/L，3 倍稀释，10 个浓度点。取5 μL 的5 倍浓度阳性对照及待测样品到384 孔反应板，空白对照组加5 μL DMSO。加入10 μL 2.5 倍激酶溶液，阴性对照孔加入等体积1 倍激酶缓冲液，室温下孵育10 min。加入10 μL 2.5 倍底物溶液，28 ℃孵育60 min 后加入35 μL 终止液终止反应。激酶检测仪读取转化率数据，计算抑制率。

2.3 抑制基质降解相关靶点抑制实验

取适量待测样品，用DMSO 将化合物配制成一定浓度的母液，用乙醇稀释到1、10 mmol/L 检测浓度的溶液（终浓度为10、100 μmol/L）。以NNGH 为阳性对照，以1300 μmol/L 的起始浓度（终浓度13 μmol/L），在DMSO 中10 倍连续梯度稀释8 个点。按照试剂盒说明书操作。

2.4 活血作用相关靶点抑制实验

2.4.1 凝血酶抑制活性实验 以阿加曲班为阳性对照，以2 mmol/L的起始浓度（终浓度200 μmol/L），在DMSO 中5 倍连续梯度稀释8 个点，转移6 μL到96 孔反应板中；待测样品转移6 μL 到反应板中，化合物终浓度为10、100 μmol/L，空白对照孔及100%酶活性对照孔每孔加入6 μL DMSO。配制含0.05 mol/L Tris buffer、0.3 mol/L NaCl、pH 7.8 的缓冲液，100%酶活性对照孔、阳性对照组及样品组各加入42 μL，空白对照组加入48 μL。用缓冲液将凝血酶（FIIa）稀释为工作浓度3 NIH/mL（终浓度0.3 NIH/mL），100%酶活性对照孔、阳性对照组及样品组各加入6 μL，37 ℃孵育5 min。用缓冲液将底物稀释为工作质量浓度2.5 mg/mL（终质量浓度0.25 mg/mL），向每组各加入6 μL，37 ℃孵育5 min，在405 nm 检测A值，计算抑制率。

2.4.2 PDE3A 抑制活性实验 5 倍反应缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.2、10 mmol/L MgCl2、0.05%NaN3、0.01%聚山梨酯-20、1 mmol/L DTT）；反应终止液（5 倍IMAP progressive binding A 溶液、5 倍IMAP progressive binding B 溶液、IMAP progressive binding bead）。阳性抑制剂曲喹辛最大给药浓度为0.1 μmol/L，3 倍梯度稀释，共10 个给药浓度，待测化合物给药浓度为10、100 μmol/L。

将化合物用DMSO 在Echo384 孔板上稀释到所需要的浓度，用Echo550 仪器从Echo384 孔板中转移200 nL 样品到384 反应板中，阴性对照（加酶组）和阳性对照（不加酶组）均转移200 nL 的100%DMSO。将PDE3A 加入1 倍反应缓冲液，形成终质量浓度为0.075 µg/mL 的2 倍酶溶液。将FAM 标记的cGMP 加入1 倍反应缓冲液，形成2 倍底物溶液。向384 孔反应板孔中加入10 μL 的2 倍酶溶液，对于无酶活对照孔，用10 μL 的1 倍反应缓冲液替代酶溶液，1000 r/min 离心1 min，室温下孵育15 min，每孔中加入10 μL 的2 倍底物溶液，1000 r/min离心1 min，室温反应30 min，每孔中加入60 μL 的反应终止液终止反应，室温下摇床600 r/min 振荡避光孵育 60 min。用酶标仪读数，参数设置Ex480/Em535(s)，Em535(p)，计算抑制率。

2.4.3 ADRA1A 受体拮抗活性实验 以肾上腺素和WB4101 为阳性激动化合物和阳性拮抗化合物，最高检测浓度为4 μmol/L，4 倍稀释，10 个浓度点。19 个化合物用DMSO 配制，最终检测浓度为10、100 μmol/L，DMSO 体积分数均未超过0.2%。稳定表达ADRA1A 受体的CHO-K1 细胞以1.5×104个/孔接种到384 微孔板，过夜培养后加入20 μL 染料，再加入10 μL 配制好的样品溶液后在培养箱中孵育1 h，再于室温平衡15 min。检测时，将细胞板、阳性激动剂板放入FLIPR 内指定位置，由仪器自动加入12.5 μL 的5×EC80浓度的阳性激动剂，运行抑制剂检测程序，仪器总体检测时间为120 s，在第21 秒时自动将12.5 μL 阳性激动剂加入到细胞板内。以1～20 s 的平均荧光强度值作为基线，21～120 s 的最大荧光强度值减去基线值即为相对荧光强度值（ΔRFU）。

激活率＝(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC100激动剂－ΔRFU背景)

抑制率＝1－(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC80激动剂－ΔRFU背景)

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 抑制滑膜炎症相关靶点实验结果

3.1.1 COX-2 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂塞来昔布对COX-2 的抑制率曲线（图1），计算得到IC50值为10.73 nmol/L。19 个化合物对COX-2 抑制活性实验结果见图2。由结果可知，与阴性对照组比较，丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B在10、100 μmol/L 对该酶抑制率达80%以上，均有显著抑制活性（P＜0.001）；藁本内酯在10、100 μmol/L 对该酶也有较显著抑制作用（P＜0.05、0.001），且都有一定浓度相关性。人参皂苷Rb1、阿魏酸在100 μmol/L 浓度对该酶抑制率均在70%以上，丹参酮IIA、党参炔苷在100 μmol/L 浓度对该酶抑制率均在50%以上，均有显著抑制活性（P＜0.001）；士的宁、茯苓酸、牛膝皂苷D 在10、100 μmol/L 对该酶抑制率在30%，且都具有显著性差异（P＜0.01、0.001）。

图1 阳性化合物活性曲线 (n = 2)Fig.1 Activity curves of positive compounds (n = 2)

图2 19 个化合物对COX-2 抑制活性 (n = 2)Fig.2 Inhibitory activity of 19 compounds against COX-2 (n = 2)

3.1.2 NOS 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂DPI 对NOS 的抑制率曲线（图1），其IC50为22.68 nmol/L。19 个化合物对NOS 抑制活性结果见图3。由结果可知，与阴性对照组比较，迷迭香酸、丹酚酸B 在10、100 μmol/L 对NOS 均有显著抑制活性（P＜0.001），且100 μmol/L 浓度下抑制率达100%以上，抑制活性最强；人参皂苷Rb1、藁本内酯、马钱子碱、士的宁、党参炔苷在10、100 μmol/L 均有显著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001）；丹参素、蜕皮甾酮、甘草苷、茯苓酸、三七皂苷R1、白术内酯III 在100 μmol/L 浓度对该酶有显著抑制作用（P＜0.01、0.001）。

图3 19 个化合物对NOS 抑制活性 (n = 2)Fig.3 Inhibitory activity of 19 compounds against NOS (n = 2)

3.1.3 NF-κB 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性激动剂TNF-α 对NF-κB 的激动结果及细胞存活率（图1），计算得到EC50为1.33 ng/mL，50%的细胞发生细胞毒性反应的浓度（median cytotoxic concentration，CC50）＞1000 ng/mL。19 个化合物对NF-κB 抑制活性及对细胞存活率影响见图4、5。由结果可知，与阴性对照组比较，藁本内酯、茯苓酸、马钱子碱在100 μmol/L 对TNF-α 诱导的NF-κB 均有显著抑制活性，但结合细胞存活率结果，以上3个化合物在该浓度下的细胞存活率分别为67.5%、65.4%、87.0%，均显示出显著毒性（P＜0.05、0.001），因此推测藁本内酯、茯苓酸、马钱子碱对NF-κB 抑制活性为假阳性结果；丹参素、阿魏酸低、高浓度及丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮IIA、甘草次酸高浓度和藁本内酯低浓度对NF-κB 均有显著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001），且无细胞毒性。

图4 19 个化合物对NF-κB 抑制活性 (n = 2)Fig.4 Inhibitory activity of 19 compounds against NF-κB (n = 2)

图5 19 个化合物细胞存活率结果 (n = 2)Fig.5 Cell survival rate results of 19 compounds (n = 2)

3.1.4 CCR4 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性拮抗剂C-021 对CCR4 的拮抗结果（图1），计算得到IC50为1.80 μmol/mL。19个化合物对CCR4拮抗活性见图6。由结果可知，与阴性对照组比较，藁本内酯在低、高浓度对CCR4 均有显著拮抗活性（P＜0.001），且呈浓度相关性；甘草次酸在高浓度对CCR4 有显著拮抗活性（P＜0.001），其他化合物无显著拮抗作用。

图6 19 个化合物对CCR4 抑制活性 (n = 2)Fig.6 Inhibitory activity of 19 compounds against CCR4 (n = 2)

3.2 抑制血管翳形成实验结果

通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂星形孢菌素对VEGFR2/KDR 的抑制率曲线（图1），其IC50为8.40 nmol/L。19 个化合物对VEGFR2/KDR抑制活性结果见图7。由结果可知，与阴性对照组比较，茯苓酸、牛膝皂苷D 在低、高浓度对该靶点有较强抑制作用（P＜0.01、0.001），抑制率最高分别为77.77%、60.51%；丹参素在高浓度抑制率为62.26%，有较好抑制作用（P＜0.001）；丹酚酸B、人参皂苷Rg1、马钱子碱在低、高浓度有较弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）；甘草次酸、三七皂苷R1、藁本内酯、迷迭香酸、甘草苷、阿魏酸在高浓度下对该酶均有较弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）。

图7 19 个化合物对VEGFR2/KDR 抑制活性 (n = 2)Fig.7 Inhibitory activity of 19 compounds against VEGFR2/KDR (n = 2)

3.3 抑制基质降解相关靶点实验结果

通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂NNGH对MMP-3 的抑制效应曲线，见图1，其IC50值为18.14 mmol/L。19 个化合物对MMP-3 抑制活性实验结果见图8。结果表明，与阴性对照组比较，丹参素、藁本内酯、丹酚酸B、迷迭香酸在低、高浓度对MMP-3 表现出显著抑制作用（P＜0.01、0.001），其中藁本内酯抑制率分别为70.84%、73.79%，丹参素高浓度抑制率为73.56%，均显示较强抑制活性。党参炔苷在高浓度亦有较弱抑制活性（P＜0.05），其他化合物无显著抑制作用。

图8 19 个化合物对MMP-3 抑制活性 (n = 2)Fig.8 Inhibitory activity of 19 compounds against MMP-3 (n = 2)

3.4 活血作用相关靶点实验结果

3.4.1 凝血酶实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂阿加曲班对凝血酶的抑制率曲线（图1），其IC50为602.30 nmol/L。19 个化合物对凝血酶抑制活性结果见图9。由结果可知，与阴性对照组比较，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹参酮IIA、丹参素在低、高浓度对凝血酶均有显著的抑制活性（P＜0.01、0.001），且除丹参酮IIA外，其他4 个化合物都呈现浓度相关性。

图9 19 个化合物对凝血酶抑制活性 (n = 2)Fig.9 Inhibitory activity of 19 compounds against thrombin (n = 2)

3.4.2 PDE3A 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性抑制剂曲喹辛对PDE3A 的抑制率曲线（图1），其IC50为0.09 nmol/L。19 个化合物对PDE3A抑制活性结果见图10。由结果可知，与阴性对照组比较，丹酚酸B、迷迭香酸在低、高浓度下对该酶均有显著抑制作用，并呈浓度相关性（P＜0.001），且在高浓度下抑制率达100%以上，抑制活性强；丹参素、藁本内酯及甘草苷在高浓度时对PDE3A 抑制活性也较显著（P＜0.001），其他化合物无显著抑制作用。

图10 19 个化合物对PDE3A 抑制活性 (n = 2)Fig.10 Inhibitory activity of 19 compounds against PDE3A (n = 2)

3.4.3 ADRA1A 实验结果 通过多浓度梯度给药，得到阳性拮抗剂WB4101 对ADRA1A 的拮抗曲线（图1），其IC50为18.09 nmol/L。19 个化合物对ADRA1A 拮抗活性结果见图11。由结果可知，与阴性对照组比较，马钱子碱在低、高浓度对ADRA1A拮抗率分别为96.78%、74.54%，拮抗作用强（P＜0.001）且呈现浓度相关性；甘草次酸及藁本内酯高浓度和人参皂苷Rb1低浓度对ADRA1A 拮抗率分别为97.32%、64.09%、65.56%，也有较显著拮抗活性（P＜0.001）。其他化合物无显著拮抗作用。

图11 19 个化合物对ADRA1A 抑制活性 (n = 2)Fig.11 Inhibitory activity of 19 compounds against ADRA1A (n = 2)

4 讨论

RA 以持续性滑膜炎和血管生成为特征，导致滑膜增生及骨骼和软骨的渐进性破坏[7]。成纤维样滑膜细胞是除T 细胞和B 细胞外，RA 发生、发展的一个重要关键因素，在RA 炎症反应和关节损伤方面起着非常重要的作用[8-10]。B 细胞活化产生的炎症反应诱导剂淋巴毒素β（lymphotoxin β，LTβ），滑膜巨噬细胞释放的TNF-α、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 等细胞因子以及树突细胞分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）促使Th17细胞分化的IL-17 共同刺激成纤维样滑膜细胞过度增殖不断产生大量炎性细胞因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α 等，同时这些炎症因子可以诱导或加速成纤维样滑膜细胞转化和迁移；产生的大量血管生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通过与其受体VEGFR2/KDR 结合，可促进血管形成，而不可控的新生血管形成可以导致炎细胞浸润、滑膜组织增生，形成血管翳-软骨结合和血管翳-骨结合，最终导致软骨和骨破坏[11]；产生的MMP-3，可加重关节疼痛、肿胀、骨侵蚀和软骨破坏等症状[12]。活化的成纤维样滑膜细胞在炎症因子如TNF-α、IL-6 和IL-17 的激发下，成纤维样滑膜细胞表达NF-κB 受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）增多，同时大量的巨噬细胞集落刺激因子与前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）刺激成骨细胞中RANKL 表达升高，其与破骨细胞前体细胞表面的NF-κB 受体活化因子（receptor activator of NFκB，RANK）特异结合，通过激活下游NF-κB，促进与破骨分化相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）、MMP-1和MMP-3等表达，促使破骨细胞发生融合，细胞骨架重塑，促进骨吸收和骨质溶解，最终引起关节骨质侵蚀破坏[13-16]。本研究结果表明，痹祺胶囊中丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、人参皂苷Rb1、阿魏酸等主要成分能显著抑制COX-2 活性，进而降低PGE2表达，抑制炎性及致痛反应；茯苓酸、牛膝皂苷D、丹参素、丹酚酸B、人参皂苷 Rg1、马钱子碱等成分能显著抑制VEGFR2/KDR 活性，从而减少新生血管形成；丹参素、藁本内酯、丹酚酸B、迷迭香酸能显著抑制MMP3活性，减少基质降解，减缓软骨破坏（图12）。

NF-κB 作为核转录因子介导细胞存活、增殖、凋亡及免疫应答等多种生物过程，与RA 发病密切相关[17]。T 细胞、B 细胞表面上的抗体与对应受体结合，刺激三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）的形成，导致细胞内Ca2+浓度迅速升高[18-19]，激活下游活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）级联信号反应的正调控[20]及NF-κB 信号通路，最终调节Th1、Th2、Th17 细胞分化并产生γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、IL-12、IL-17 等细胞因子，同时使得活化后的B 细胞产生免疫球蛋白，进而在机体自身免疫反应及炎症反应中共同发挥调节作用[21-23]。另外，CC 亚族趋化因子配体22（CC chemokine ligand 22，CCL22）通过靶向作用受体CCR4 激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K），进一步调节NF-κB 信号通路，最终作用于DNA 转录因子释放趋化因子CXCL1、CXCL2、CCL7 等，在细胞迁移、凋亡及细胞存活等方面发挥作用[24]。研究表明，RA 患者关节液中NO水平升高，NO 是一种重要的致炎因子，由NOS 催化L-精氨酸生成，在滑膜炎症部位介导许多不同的细胞功能，包括细胞因子产生、信号转导、线粒体功能和细胞凋亡[25]（图13）。本研究结果表明，痹祺胶囊中丹参素、阿魏酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮IIA、甘草次酸、藁本内酯对NF-κB 有显著拮抗作用；藁本内酯、甘草次酸对CCR4 有显著拮抗作用；迷迭香酸、丹酚酸B、人参皂苷Rb1、藁本内酯、马钱子碱、士的宁、党参炔苷等成分对NOS 有显著抑制活性。

RA 属于中医“痹证”范畴，归属于血瘀证。研究表明，血瘀证是RA 的基本病机之一[26]。凝血酶通过与其受体F2R 作用，激活磷酯酶Cβ（phospholipase Cβ，PLCβ），并特异性水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）为IP3和DAG 2 个第二信使，从而激活Ca2+信号通路，随着胞质内Ca2+浓度升高，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）被激活，通过磷酸化调节下游信号传递，最终引起血小板聚集[27]。另一方面，ADRA1A 被激动后，同样可通过PLCβ 激活Ca2+信号通路，肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）可由钙调蛋白2（calmodulin 2，CALM2）激活，进而对肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）进行磷酸化，使肌动球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，最终引起血管平滑肌的收缩[28]。此外，CALM2 可通过激动腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）产生cAMP，进一步活化蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），最终调节MLC，松弛血管平滑肌[29]（图14）。本研究发现，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹参酮IIA、丹参素能显著抑制凝血酶活性；马钱子碱、甘草次酸、丹参素、藁本内酯、人参皂苷Rb1能显著拮抗ADRA1A；丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、藁本内酯、甘草苷能显著抑制cAMP 降解酶PDE3A 活性，提高cAMP 含量。由此推测，痹祺胶囊通过干预凝血酶、PDE3A 及ADRA1A，进而抑制血小板聚集、促进血管平滑肌舒张，发挥活血作用。

图14 痹祺胶囊活血作用机制Fig.14 Mechanism of Biqi Capsule in promoting blood circulation

综上，COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2、MMP3、凝血酶、PDE3A、ADRA1A 可能为痹祺胶囊治疗RA 的部分作用靶点。其主要成分通过抑制COX-2、NOS、VEGFR2/KDR、MMP3 活性，拮抗NF-κB、CCR4，抑制滑膜炎性反应、滑膜异常增生、血管翳形成及关节软骨破坏；通过抑制凝血酶及PDE3A 活性，拮抗ADRA1A，抑制血小板聚集、促进血管平滑肌舒张，发挥活血作用。由于实验方法有限，本研究仅对RA 相关的几个靶点进行实验研究，后续还应聚焦更多关键靶点进行更全面深入的探索。另外，本研究采用的是体外酶活性测定方法，缺少了机体对成分的吸收、代谢等的影响，并且本研究是对单个化合物独立效果的分析，未开展组分配伍的活性研究，故后续实验还需针对以上几点开展体内验证及配伍研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突