高明地区手足口病EV71的分子流行病学情况及核酸序列同源性的进化性分析

钟剑文 陈卓仪 陈健珍 谭安琦 刘翠娴 张 宇

广东省佛山市高明区人民医院检验科 528500

手足口病系肠道病毒引起以幼儿为主要发病群体的临床常见传染性疾病,其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)为最常见的病原体,此外,非EV71/CA16的肠道病毒也占一定比例[1]。既往已有学者对手足口病流行特点进行分析[2],但有关EV71的分子流行特征及基因同源性进化情况目前尚无报道。为进一步明确EV71流行的分离株基因特征及其变异趋势,本文以高明地区手足口病阳性标本为例,调查EV71的分子流行病学,并进行核酸序列同源性进化分析,以期为手足口病的临床早期防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选择2020年1月—2022年12月高明区人民医院及疾控中心提供来源于1 547例手足口病患者的阳性标本共1 547份,其中2021年802份,2022年745份,包括普通病例(轻型)、重症病例和死亡病例的粪便标本和咽拭子标准,-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取。采用PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司生产),按照试剂盒说明书进行病毒RNA提取操作。将提取到的病毒RNA溶解于40μl洗脱液当中,并于-20℃保存。

1.2.2 RT-PCR检测。将提取到的病毒RNA作为模板,进行扩增操作,选择引物为肠道通用引物、EV71型特异性引物及柯萨奇A组16型特异性引物,采用SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司生产)进行RT-PCR扩增,引物序列和反应条件参照《手足口病预防控制指南(2008年版)》[3]。

1.2.3 EV71病毒VP1区核苷酸序列扩增。从2021年手足口病EV71阳性样本中随机选取6份样本进行RNA VP1区扩增操作,引物为(1)(2),扩增片段全长为1 042bp,SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit试剂盒扩增反应条件为:50℃下反应35min,94℃下反应5min;95℃下反应15min;95℃下反应30s,50℃下反应25s,72℃下反应70s,共进行32个循环;72℃下反应10min。反应结束后,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。随后将获得的EV71 VP1区PCR扩增产物委托佛山市瑞因基因科技有限公司进行回收测序。(1)EV71-vp1-F:5,-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3(nt 2372～nt 2392);(2)EV71-vp1-R:5-AAGTCGCGAGAGCTGTCYRC-3(nt 3434～nt 3454)。

1.2.4 DNA序列测定和分析。采用DNASTAR、Mega 4.0软件,参比GenBank数据库中序列,进行VP1片段全部基因序列的氨基酸和核苷酸序列分析及进化分析。

2 结果

2.1 分子流行病学结果

2.1.1 2021年和2022年高明地区各月份手足口病病毒类型分布。2021年和2022年高明地区均以5—7月为手足口病高发时间,2021年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分别为38.79%(64/165)、42.86%(87/203)、35.80%(63/176),2022年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分别为40.00%(60/150)、41.97%(81/193)、36.14%(60/166)。EV71病毒引起的手足口病高发时间为5—7月,CA16病毒引起的手足口病高发时间为5—6月,非EV71/CA16(N)肠道病毒引起的手足口病高发时间为6—7月,EV71/CA16共感染引起的手足口病病例数较少。详见表1、图1。

表1 2021年和2022年高明地区各月份手足口病病毒类型分布(例)

2.1.2 2021年和2022年高明地区与佛山市其他地区手足口病病毒类型分布。结合佛山市其他4个区手足口病流行病学结果,2021年高明区、禅城区、顺德区、南海区、三水区EV71病毒引起的手足口病占比分别为36.41%(292/802)、37.00%(367/992)、34.92%(242/693)、34.35%

(294/856)、36.49%(270/740),2022年高明区、禅城区、顺德区、南海区、三水区EV71病毒引起的手足口病占比分别为36.11%(269/745)、38.05%(371/975)、36.48%(255/699)、36.95%(303/820)、35.61%(255/716)。详见表2、图2。

表2 2021年和2022年高明地区与佛山市其他地区手足口病病毒类型分布(例)

图2 2021年(图左)和2022年(图右)高明地区与佛山市其他地区手足口病病毒类型分布

2.1.3 2021年和2022年高明地区各年龄段手足口病病毒类型分布。年龄方面,2021年和2022年手足口病均以≤1岁患者为主要发病群体,其中,2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分别为36.36%(124/341)、29.62%(101/341)、32.84%(112/341)、1.17%(4/341),2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分别为36.28%(115/317)、29.97%(95/317)、33.44%(106/317)、0.32%(1/317)。性别方面,2021年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分别为2.073∶1和2.140∶1,2022年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分别为2.066∶1和2.092∶1。详见表3、图3。

表3 2021年和2022年高明地区各年龄段手足口病病毒类型分布

图3 2021年(图左)和2022年(图右)高明地区各年龄段手足口病病毒类型分布

2.1.4 病例类型分布。2021年,802例病例中普通病例790例,重症病例10例,死亡病例2例,其中EV71病毒引起的手足口病的重症和死亡病例占比分别为1.03%(3/292)和0.34%(1/292)。2022年,745例病例中普通病例738例,重症病例8例,无死亡病例,其中EV71病毒引起的手足口病的重症病例占比为0.74%(2/269)。详见表4。

表4 2021年和2022年高明地区各病例类型手足口病病毒类型分布

2.2 EV71基因VP1编码区基因同源性分析

图4 高明地区6株EV71毒株与国内外代表株

2.2.1 高明地区6株毒株与9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性。本研究从EV71阳性标本中随机选择6个样本进行EV71 VP1基因全长序列扩增,通过序列测定获得EV71病毒VP1区的全基因序列为891bp,未见核苷酸插入或缺失。6株EV71 VP1高明地区分离株序列与EV71原A、B、C各基因型代表株以及其他地区流行株序列进行比较,核苷酸和氨基酸同源性详见表5、表6。

表5 2021年高明地区6株毒株与9株EV71代表株VP1片段的核苷酸同源性(%)

表6 2021年高明地区6株毒株与9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性(%)

2.2.2 高明地区6株毒株EV71 VP1片段之间核苷酸和氨基酸序列同源性。6株EV71在VP1区之间核苷酸和氨基酸同源性分别为97.5%～99.6%和99.6%～100.0%。详见表7。

表7 高明地区6株毒株EV71 VP1片段之间核苷酸和氨基酸序列同源性(%)

2.2.3 系统进化分析。基于EV71 VP1编码基因核苷酸序列,以及Genebank数据库,对高明地区分离出的6株EV71构建亲缘进化树。详见图4。

3 讨论

本研究结果显示,EV71和CA16病毒均为高明地区引起手足口病的主要病原体,EV71近2年的病例占比分别为36.41%和36.11%,后者分别为29.55%和29.93%,其中2022年EV71占比虽然较2021年有所降低,但差异不明显;5—7月为EV71病毒引起手足口病高发时间,相比CA16和非EV71/CA16有更长的流行期;≤1岁患者为手足口病高发群体,2021年和2022年EV71病例占比分别为36.36%和36.28%,远高于其他年龄,且近2年无明显变化;男性为手足口病高发群体,2021年和2022年EV71病例男女比例分别为2.140∶1和2.092∶1。以上结果均充分表明,EV71依然是高明地区引起手足口病的主要病原体。本研究另一项结果显示,非EV71/CA16的肠道病毒在手足口病致病方面也具有较重地位,与林峰等[4]的研究结果一致。本研究对近2年的手足口病病例中,重症病例和死亡病例仅为17例和2例,而导致这一现象的原因,笔者认为,一方面可能是由于广东省区域内手足口病的EV71流行毒力株较弱,另一方面可能与近年来广东省对手足口病预防的重视程度逐年上升,并有EV71疫苗上市有关。但对于EV71与CA16对患者疾病严重程度的影响,本研究数据尚未见到显著差异,与既往研究[5]中指出EV71相比CA16更容易引起重症和死亡的观点相悖,可能与本研究纳入样本数量较少有关。基因同源性分析结果显示,基于高明地区样本中分离出的6株EV71毒株构建的亲缘进化树,进化树可见高明地区EV71毒株与C4亚型代表处于同一分支,说明高明地区EV71毒株属于C4型。

EV71病毒是2021—2022年高明地区手足口病流行的主要病原体,但是近年来由非EV71/CA16病毒引起的手足口病比例也有上涨趋势,因此,未来需要对手足口病的各类型病原体的流行趋势均需要进行谨慎研究分析。