联合BRAFV600E突变及TERT启动子突变基因检测对判断甲状腺乳头状癌侵袭性价值研究*

林 占 李 枢 师 柔 李德祥 黄卓雅 廖观生

广东省惠州市中心人民医院 516000

近年来随着环境、生活习惯及工作压力的改变,甲状腺恶性肿瘤发病率逐年上升,甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer,PTC)是临床上最为常见的甲状腺恶性肿瘤,与20世纪90年代比较,PTC发病率上升了近50%[1-2]。多数PCT患者的10年存活率较高,但是如果侵犯到颈前肌肉、血管等甲状腺外面的结构,则其10年存活率就会显著降低,并且对治疗效果和预后造成影响[3],因此,急需探究分子标记物对PTC侵袭性进行评估,以提高治疗效果,本文旨在探讨联合BRAFV600E突变及TERT启动子突变基因检测对判断甲状腺乳头状癌侵袭性价值,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年6月—2023年4月在本院手术证实的120例甲状腺乳头状癌(PTC)患者病理标本。纳入标准:所有患者手术前未进行任何辅助治疗,资料完整,知情同意自愿参与研究。排除标准:合并严重心肝肾功能不全、其他恶性肿瘤、精神障碍、糖尿病、吸烟酗酒、妊娠期或哺乳期患者。所选患者中男24例,女96例,年龄28～57岁,平均年龄(41.33±9.01)岁,肿瘤直径:<1.0cm 45例,≥1.0cm 75例,UICC分期:Ⅰ～Ⅱ期57例,Ⅲ～Ⅳ期63例,双侧累及63例,根据病灶是否突破甲状腺被膜或有无发生淋巴结转移,分为侵袭组55例和惰性组65例。

1.2 检测方法 DNA样本提取:按照蜡切片样品DNA提取试剂盒(型号:FFPE DNA,Cat NO.ADx-FF01)说明书提取样本DNA,所提取的DNA质量在超微量分光光度计(OD-2000TM)上检测,DNA模板浓度标化(2.0ng/μl)。

BRAF V600E突变检测:使用美国Applied-Biosystems公司提供的荧光定量PCR系统并按照人BRAF基因V600E突变检测试剂盒(ADx-BR01、ADxBR02)说明书要求检测BRAF基因突变,设置阴性对照、阳性质控,按照说明书要求判定结果:需满足样本、阳性质控的内控信号升高,阳性质控的外控信号Ct值低于20,结果:样本Ct值低于28则判定BRAF V600E突变,样本Ct值28及以上则判定为未突变[4]。

TERT基因启动子突变检测:使用美国Applied-Biosystems公司提供的荧光定量PCR系统,并按照人TERT基因启动子突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法,货号:RPQ008)说明书要求检测TERT C228T和C250T突变,设置阴性对照、阳性质控,按照说明书要求判定结果:需满足样本、阳性质控的内控信号升高,阴性对照内、外控信号均未升高,阳性质控外控信号Ct值低于14,结果:样本外控信号Ct值低于25则判定为基因突变,Ct值25及以上则判定为未突变[5]。

1.3 研究方法 对侵袭组与惰性组患者BRAFV600E、TERT启动子两个位点突变阳性率以及临床因素(年龄、性别、肿瘤直径、UICC 分期、双侧累及)进行分析,并统计侵袭性的危险因素。

2 结果

2.1 侵袭组与惰性组患者临床因素差异分析 侵袭组与惰性组患者性别、年龄、肿瘤直径、UICC分期、双侧累及情况差异均具有统计学意义(P<0.05),其中侵袭组患者男性患病率更高,年龄更小,肿瘤直径更大,UICC分期更高,双侧累及更多,见表1。

表1 侵袭组与惰性组患者临床因素差异分析[n(%)]

2.2 侵袭组与惰性组患者BRAFV600E突变及TERT启动子突变基因差异分析 侵袭组患者BRAFV600E、TERT启动子突变率,以及BRAFV600E+TERT启动子同时突变率均显著高于惰性组,差异均具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 侵袭组与惰性组患者BRAFV600E突变及TERT启动子突变基因差异分析[n(%)]

2.3 甲状腺乳头状癌侵袭性危险因素Logistic回归分析 以PTC患者是否表现为侵袭性为应变量Y,以性别、年龄、肿瘤直径、UICC分期、双侧累及情况、BRAFV600E、TERT启动子突变情况作为自变量X进行Logistic回归分析,结果显示:性别、年龄、肿瘤直径、UICC分期、双侧累及情况、BRAFV600E、TERT启动子突变均进入方程,且均为PTC患者侵袭性的危险因素,见表3、表4。

表3 甲状腺乳头状癌侵袭性危险因素Logistic回归分析赋值表

表4 甲状腺乳头状癌侵袭性危险因素Logistic回归分析结果

3 讨论

根据甲状腺癌治疗指南建议,病灶已经发生淋巴结转移、甲状腺外侵犯、远处转移侵袭性PTC患者推荐采取手术治疗,而对于病灶未出现淋巴结转移、甲状腺外侵犯及远处转移患者推荐采取随访观察,随访期间若发展为侵袭性PTC则给予手术治疗也可[6-7]。因此,如何及早诊断PTC患者的侵袭性是临床上的一大难点,既往多采取超声、单一基因检测(BRAFV600E、TERT启动子),预测价值较低,难以准确地区分PTC患者的侵袭性,本研究旨在检测 BRAFV600E突变及TERT启动子突变,对侵袭组与惰性组之间的BRAFV600E、TERT启动子两个位点突变阳性率以及临床因素进行分析,并统计侵袭性的危险因素,探讨其判断PTC患者侵袭性的价值,为临床上选择合适的方式治疗PTC患者提供依据。

本研究纳入样本120例,侵袭组55例,占45.83%,仅发生突破甲状腺被膜10例,仅发生淋巴结转移32例,同时突破甲状腺被膜和发生淋巴结转移13例,惰性组65例,占54.17%,侵袭组男性发病率为62.50%显著提高(P<0.05),表明男性PTC患者表现为侵袭性的风险显著高于女性,侵袭组患者平均年龄为(38.27±8.26)岁显著较低(P<0.05),表明PTC患者侵袭性的发生更倾向于年轻人,肿瘤直径>1cm中60%的患者表现为侵袭,肿瘤直径<1cm中29.82%表现为侵袭,UICC分期Ⅲ～Ⅳ期60.32%患者表现为侵袭,Ⅰ～Ⅱ期29.82%患者表现为侵袭,且累及双侧的患者中有63.49%表现为侵袭,差异均具有统计学意义(P<0.05),Logistic回归分析显示:PTC患者性别、年龄、肿瘤直径、UICC分期、双侧累及情况均为PTC患者表现为侵袭性的危险因素,表明肿瘤直径越大、UICC分期越高、累及双侧越多,表现为侵袭性的风险越大,与肿瘤进展有关,不断恶化,PTC患者逐渐表现为侵袭性[8]。

目前PTC分子标记物较多,尤其是BRAFV600E、TERT启动子(端粒酶逆转录酶)在PTC的发生、发展中发挥着重要作用,可作为判定PTC预后的重要分子标志物,侵袭组患者BRAFV600E、TERT启动子突变率显著高于惰性组,且Logistic回归分析也表明本研究显示:BRAFV600E、TERT启动子突变均是PTC患者表现为侵袭性的危险因素,与既往研究一致[9]。研究表明:BRAFV600E、TERT启动子同时突变的甲状腺患者复发率极高,存活率与BRAFV600E、TERT启动子突变均相关,两个基因位点同时突变时,PTC患者的临床病理特征最差,尤其是淋巴结转移和甲状腺腺外[10],本研究Logistic回归分析显示:BRAFV600E、TERT启动子突变、BRAFV600E+TERT启动子同时突变均为PTC患者变现为侵袭性的危险因素,且BRAFV600E+TERT启动子同时突变的OR值最大,表明BRAFV600E+TERT启动子同时突变时,PTC患者表现为侵袭性的风险最大,BRAFV600E+TERT启动子同时突变,TERT mRNA表达水平异常增高,与BRAFV600E突变导致的MAPK通路异常激活,促使细胞无限分裂、增殖,细胞极易发生端粒危机,TERT启动子发生突变的概率增加,活化端粒酶,保证细胞的永生化,并且BRAFV600E突变造成ETS转录因子增加,结合在TERT启动子突变后产生的新位点上,增强TERT的转录活性[11]。

综上所述,联合BRAFV600E突变及TERT启动子突变与甲状腺乳头状癌侵袭性相关,虽然机制尚未明确,但可以作为判断PTC患者侵袭性的分子标志物,同时也要适当考虑患者的年龄、性别、肿瘤直径、UICC分期、双侧累及情况,为PTC患者治疗方案的选择提供依据。