溶血情况对免疫比浊法检测过敏原IgE水平的影响分析

潘仁霞 陈丽惠 郭钦玉

平潭综合实验区医院检验科,福建省平潭县 350499

过敏性疾病是一种发展迅速的多系统综合征,严重者甚至引起过敏性休克,威胁患者生命安全[1]。作为典型总免疫球蛋白E(Immu-noglobulin E,IgE)介导的过敏反应关键介质,IgE在临床被作为诊断过敏性疾病的生物指标。荧光酶免疫法是血清IgE体外测定的“金标准”,但该检查方法对仪器、环境、试剂要求严苛,且检验价格昂贵导致部分医疗机构,尤其是基层医疗机构选择免疫比浊法检测[2]。以往研究发现,血液样本溶血会干扰免疫比浊法分析结果[3]。而在临床实际工作中,血液样本不可避免地受到采集方法、保存等的影响出现溶血。因此,有必要探明溶血对血清IgE分析的干扰,并找出减少溶血血样中干扰的有效方法。鉴于此,本研究纳入过敏性疾病患者血液样本,旨在探讨溶血情况对免疫比浊法检测过敏原IgE水平的影响。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2022年1—5月我院49例过敏性疾病患者为观察对象。纳入标准:(1)符合过敏性疾病的诊断标准,年龄20～50岁;(2)签署知情同意书者。排除标准:(1)合并其他免疫性疾病者;(2)入组前1周使用相关抗过敏药物者;(3)合并血液性疾病,凝血功能障碍等影响患者血清IgE测量水平的疾病者。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂。试剂:IgE免疫比浊法试剂盒及IgE标准品均来自Beckman Coulter。主要组成包括:反应缓冲液、鼠抗人IgE单克隆抗体乳胶粒、校准人IgE、牛血清白蛋白。仪器:Beckman Coulter IMMAGE 800特定蛋白分析仪。

1.2.2 血液样本制备。采集49例过敏性疾病患者血液样本10ml,取1ml未溶血的血液,在3 000g的离心条件下离心20min后取上清液,作为未溶血血清标本;另取1ml未溶血的血液在-20℃冷冻,并在室温(约24℃)下缓慢解冻五个循环,以制备完全溶血的血液样本。后取2ml未溶血血液以3 000g离心10min,收集所有上层血清作为用于总IgE分析和制备不同水平溶血血清样品。将剩下血细胞与生理盐水溶液混合至总体积为5ml,然后将混合物以3 000g离心10min,收集下层血细胞,弃去上清液,在混合—离心—丢弃的五个循环后,最终确保上清液总IgE浓度<0.1IU/ml。将反复洗涤后收集的血细胞通过反复冻融(参考完全溶血血液样本制作),制备浓缩的溶血血样,测定血红蛋白浓度。根据血红蛋白浓度,选取不同体积的浓缩溶血血样和血清配比,制备血红蛋白浓度分别为10g/L、20g/L、50g/L、100g/L、120g/L、150g/L、200g/L,体积均为200μl的不同溶血样本。样本制备完成后储存在-80℃,用于IgE的检测分析。

1.2.3 血清IgE测量。所有不同溶血水平的样本均根据检验操作流程采用免疫比浊法测定血清总IgE。

2 结果

2.1 不同程度溶血过敏原IgE水平的影响 混合物中总IgE的测试浓度低于相应的计算浓度,并且|偏差(%)|随着溶血水平的增加而增加,表明溶血对通过免疫比浊法检测的血清IgE分析产生负面干扰,并且溶血越严重,干扰越大,见表1。

表1 不同溶血程度血清的测试浓度、计算浓度和|偏差(%)|(n=49)

2.2 稀释后计算浓度与血清浓度差异 将49例完全溶血样本[HB:(135.27±43.37)g/L]用9倍体积的生理盐水自动稀释至最终血红蛋白浓度低于20g/L[HB(13.71±4.52)g/L]。结果显示:稀释后样本测试浓度乘以10得出计算浓度(范围:1.74～541.00IU/ml,中值:21.33IU/ml),显著低于血清总IgE浓度(范围:3.62～943.79IU/ml,中值:40.13IU/ml)(P<0.05),表明仅稀释完全溶血的血液不能用于估计血清IgE水平。

2.3 完全溶血血液和血清总IgE浓度的线性回归分析 对所有49个样本进行了线性回归分析,结果显示完全溶血血液总IgE的测试浓度(x)与相应血清总IgE的测试浓度(y)显示正相关,回归公式为y=1.721x+5.78(r=0.572),见图1。使用回归公式矫正完全溶血血液总IgE的测试浓度,并获得矫正后的浓度(范围:19.53～933.57IU/ml,中位数:52.25IU/ml),该浓度与血清总IgE的浓度无显著差异(P=0.435),见图2。证实用稀释矫正法获得的矫正浓度来估计血清IgE水平的可行性。

图1 完全溶血血液和相应血清中总IgE浓度的线性回归分析

图2 血清和完全溶血血液总IgE的浓度及矫正后的浓度

2.4 矫正浓度的诊断能力验证 为了进一步验证矫正浓度的有效性,比较了血清、完全溶血血液和矫正浓度总IgE诊断能力,结果显示:矫正浓度诊断的AUC为0.892,完全溶血血液为0.828,血清为0.908,表明通过稀释矫正方法获得的矫正浓度具有与血清相同的诊断能力。见图3。

图3 矫正浓度IgE对过敏性疾病诊断能力验证

3 讨论

IgE是在过敏原等刺激物刺激人体后,人体浆细胞与B细胞释放的过敏性介质,由于过敏性疾病缺乏特异性形态学改变,导致IgE成为过敏性疾病诊断与治疗过程中重要的参考指标[4]。免疫比浊法是测量血清IgE的重要手段,但有研究指出,血清IgE含量极低,检测难度大,而获取的血液样本溶血后血细胞释放的胞内物质可能影响血清IgE的浓度,进而影响血清IgE测量水平[5]。然而,临床实际工作中,血液样本溶血无可避免,因此,探明溶血对免疫比浊法测量血清IgE分析的干扰,对提高检测结果准确性具有重要意义。

本研究结果表明,不同溶血程度血液样本总IgE均低于血清样本测试浓度,溶血对免疫比浊法检测的血清IgE分析产生负面干扰,并且溶血越严重,干扰越大。通常情况下血液中正常的血红蛋白浓度男性为130～160g/L,女性为120～150g/L,在通过免疫比浊法进行分析时,由于溶血干扰,完全溶血的血液样品总IgE减少约20%。此外,溶血后血细胞释放的血红蛋白会干扰抗原和抗体的结合影响检测的进程,溶血后血细胞释放的胞内物质还可能影响血清生物标志物的浓度[6];同时血红蛋白在光谱中具有强吸收峰,影响检测结果读取[7]。

本研究通过稀释完全溶血血液分析稀释法是否能用于血清IgE水平检测,评估发现,完全溶血血液总IgE的测试浓度(根据稀释换算)比血清浓度低,推测可能的原因为溶血后血细胞释放的细胞内物质可能有助于稀释血清总IgE,导致完全溶血血液总IgE的测试浓度比血清浓度低大约2倍。在临床上若通过测量完全溶血血液总IgE的测试浓度高于临界值,则结果可被视为阳性,但若完全溶血血液测试浓度低于临界值,则不能排除假阴性值。因此,仅稀释的完全溶血血液不能用于估计血清IgE水平。既往研究也指出,溶血可影响血清生物标志物的测量[8]。线性回归分析显示完全溶血血液总IgE的测试浓度与相应血清总IgE的测试浓度呈正相关(r=0.572),使用回归公式矫正完全溶血血液总IgE的测试浓度显示,矫正完全溶血血液总IgE浓度与血清总IgE的浓度无显著差异,ROC曲线分析显示,矫正浓度诊断能力与血清IgE相当。因此,笔者认为,当溶血严重且血清不可用时,矫正后的完全溶血血液总IgE浓度可用于评估血清中总IgE的浓度以进行诊断。

综上所述,仅稀释的完全溶血血液不能用于估计血清IgE水平,但用矫正法获得的矫正浓度来可用于估计血清IgE水平,且矫正完全溶血血液IgE浓度具有与血清相同的诊断能力。