珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性测定

桂 卿, 黄 荣, , 孙文秀, 唐利华, 黄穗萍, 陈小林, 郭堂勋, 莫贱友, 李其利*

(1.广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室 广西作物病虫害生物学重点实验室,广西 南宁 530007;2.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 434025)

珍珠李(PrunussalicinaLindl.)属蔷薇科李属,于1998年从广西天峨县当地野生李中选育而来,于2009年通过广西壮族自治区农作物品种审定委员会审定[1],是一种综合性状优良的晚熟新品种。龙滩珍珠李果实外观优美、酸甜适中、富含维C,具有“李族皇后”和“广西第一李”的美誉[2]。截止2020年,天峨县的龙滩珍珠李种植面积达8 533.3公顷,投产面积3 333.3公顷,产量可达4.8万t,产值达5亿元以上[3]。珍珠李是天峨县脱贫攻坚的主要特色产业[3],目前已在广西乐业、凌云、凤山、环江、大化和桂林以及贵州省部分地区推广种植,具有广阔的发展前景。珍珠李炭疽病又称珍珠李叶枯病,是一种由胶孢炭疽菌复合种(TheColletotrichumgloeosporioidesspecies complex)侵染引起的毁灭性病害[4],严重影响龙滩珍珠李产业的发展[5-6]。 胶孢炭疽菌复合种由22个种组成,根据多基因系统发育分析区分不同种类,形态学上具有过去50年一直使用的广义胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的典型特征[7]。化学防治是控制珍珠李炭疽病的主要措施,咪鲜胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑等药剂被广泛用于珍珠李炭疽病的防治。吡唑醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)杀菌剂[8],该类杀菌剂通过阻碍二氢泛醌与线粒体内膜外壁Qo位点的结合以及通过该位点的电子传递,从而抑制线粒体呼吸作用,最终导致细胞死亡[9],是一类具有保护、产出和治疗等多重作用的广谱、高效、低毒的内吸性杀菌剂[10]。但其作用位点单一,极易产生抗药性[11]。因此吡唑醚菌酯已被杀菌剂抗性委员会(Fungicide Resistance Action Committee, FRAC)认定为“高抗性风险杀菌剂”[12]。在国内,目前报道的人参、苦瓜、葡萄和芒果的炭疽菌对吡唑醚菌酯表现较为敏感,还未发现抗药性群体[13-15]。在国外,日本长野县苹果炭疽菌[16]、美国伊利诺伊州苹果炭疽菌[17]以及美国六个州的草莓炭疽菌[18]等均已对吡唑醚菌酯产生抗药性。咪鲜胺属于咪唑类杀菌剂,苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂,两者均属于甾醇脱甲基抑制剂(DMIs)[8],该类杀菌剂通过抑制细胞壁甾醇的生物合成,从而干扰病原菌的正常生长,是一类活性高、持续期长、杀菌谱广的具有治疗和保护作用的杀菌剂[19]。不同作物炭疽菌对咪鲜胺的敏感性存在显著差异,在我国,来源于核桃、西瓜、草莓的炭疽菌等对咪鲜胺较为敏感[20-22],但芒果炭疽菌对咪鲜胺已产生低抗[23],目前还未见有关国外作物炭疽菌对咪鲜胺产生抗药性的报道[24]。不同作物炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性也存在显著差异,我国南方主要梨炭疽菌和葡萄炭疽菌对苯醚甲环唑均表现为敏感[25-26],而杨树和枸杞炭疽菌均已出现敏感性下降的群体[27-28],甚至发现草莓炭疽菌对苯醚甲环唑表现为低抗[29]。在国外,柑橘炭疽菌[30]、草莓炭疽菌[31]、桃炭疽菌[32]和芒果炭疽菌[33]等均对苯醚甲环唑表现敏感。目前已报道多种作物病原菌对QoIs和DMIs杀菌剂产生了不同程度的抗性。但至今尚未见李树炭疽菌对各类化学药剂的敏感性和抗药性监测的相关报道。监测和评估珍珠李炭疽菌对常用化学药剂的敏感性和抗药性,对于制定和实施珍珠李炭疽菌的防控措施及科学合理选药、用药具有重要意义。2017年至2018年,从广西珍珠李主产区天峨县和贵州省2个县市分离获得26株珍珠李炭疽菌,通过形态学和分子鉴定确定为果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)、胶孢炭疽菌和雪茄罗炭疽菌(Colletotrichumcigarro) 四种,均属于胶孢炭疽菌复合种[34]。本研究拟采用菌丝生长速率法测定珍珠炭疽菌对吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺三种杀菌剂的敏感性,分别比较珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性差异,以期为珍珠李炭疽病的化学防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 2017年至2018年,从广西珍珠李主产区天峨县和贵州省的独山县、平塘县采集珍珠李炭疽病叶片,分离获得26株胶孢炭疽复合种(Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex)菌株[34],分别为21株果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、3株胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、1株暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)和1株雪茄罗炭疽菌(Colletotrichumcigarro)(表1),均于4 ℃ PDA斜面上保存。

表1 供试龙滩珍珠李炭疽菌株及其来源Table 1 Isolates and sources of Colletotrichum spp.from Longtan pearl plum

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 97.8%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)原药、97.0%苯醚甲环唑(difenoconazole)原药、98.03%咪鲜胺(prochloraz)原药,均由广西田园生化股份有限公司提供;吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑原药均用丙酮溶解并配制成4×103μg/mL的母液备用;咪鲜胺原药用丙酮和质量分数为1%的稀盐酸混合液溶解并配制成2×102μg/mL的母液备用。全自动高压灭菌锅(MLS-3781L,普和希株式会社);人工培养箱(LRH-250-GB,韶关市泰宏医疗器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性测定 取吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺母液,分别用无菌水稀释,再与PDA培养基混合均匀,配置成不同浓度梯度的含药培养基,使吡唑醚菌酯最终质量浓度分别为100、10、1、0.1和0.01 μg/mL;苯醚甲环唑最终质量浓度分别为100、10、1、0.1和0.01 μg/mL; 咪鲜胺最终质量浓度分别为5、1、0.2和0.04 μg/mL。吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑两种药剂处理以添加等量丙酮稀释液的PDA平板作为对照,咪鲜胺药剂处理以添加等量丙酮和稀盐酸稀释液的PDA平板作为对照。 采用菌丝生长速率法[29]测定珍珠李炭疽菌对吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺三种杀菌剂的敏感性。将26株菌株接种于PDA平板,25 ℃恒温光照培养5 d后,用直径5 mm的灭菌打孔器沿菌落边缘打取菌丝块,将菌丝块转接到各含药培养基中央,每组处理重复3次,25 ℃避光培养7 d,采用十字交叉法测量菌落直径,以菌丝净生长量计算不同质量浓度药剂对各菌株生长的抑制率。计算出每个试验浓度的毒力回归方程和相关系数R,求出有效中浓度(EC50)和90%最大有效浓度(EC90)。菌丝生长抑制率=((对照菌落平均直径-药剂处理菌落平均直径)/(对照菌落平均直径-菌丝块直径))×100%。

1.2.2 珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性频率分布 根据毒力回归方程y=ax+b,x表示药剂浓度对数,y表示菌丝生长抑制率所对应的几率值,通过代入菌丝生长抑制率为50%和90%所对应的几率值,求出相应的x值,从而得到EC50值和EC90值。回归系数中的R表示负相关系数,R的平方表示自变量能够解释因变量的变异程度。以EC50值为依据,从低到高顺序排列,吡唑醚菌酯以0.45 μg/mL为组距,苯醚甲环唑以0.35 μg/mL为组距,咪鲜胺以0.1 μg/mL为组距,将EC50值分为几个区间,统计各区间的菌株数,计算出各区间所对应的菌株频率(%)。以不同的EC50值区间作为横坐标,菌株中相应的频率(%)为纵坐标,采用Excel 2007软件分别绘制26株珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性频率分布图[21]。菌株频率=EC50各区间的菌株数/菌株总数。

1.2.3 不同种、不同地区珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性 统计4个不同种珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂EC50范围,并计算平均EC50值,进行方差分析得出不同种珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性差异显著程度。按不同地区将分离得到的26株珍珠李炭疽菌分成六类,计算各地区珍珠李炭疽菌对不同杀菌剂EC50范围和敏感性指数。 敏感性指数=杀菌剂对某地区菌株的EC50均值/杀菌剂对总体菌株的EC50均值。

1.2.4 数据分析 以药剂浓度对数为横坐标,通过查询生物统计几率值换算表,以菌丝生长抑制率所对应的几率值为纵坐标,使用Excel 2007软件采用最小二乘法计算出每个试验浓度的毒力回归方程和相关系数R、求出EC50和EC90。采用DPS 3.01软件就不同种或不同地区的珍珠李炭疽菌对三种药剂的敏感性进行单因素方差分析,采用最小显著差异法(LSD)进行结果检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性

一般而言,随着EC50数值增大,杀菌剂毒性减弱,两者呈负相关。从敏感性测定结果(表2)可知,吡唑醚菌酯对供试26株珍珠李炭疽菌的EC50值介于0.058 3～84.566 0 μg/mL之间,最小和最大EC50值相差1 450倍,平均EC50值为(6.276 3±3.525 5) μg/mL;苯醚甲环唑对供试26株珍珠李炭疽菌的EC50值介于0.165 8～2.168 0 μg/mL之间,最小和最大EC50值相差13倍,平均EC50值为(0.725 8±0.088 0) μg/mL;咪鲜胺对供试26株珍珠李炭疽菌的EC50值介于0.010 8～0.645 2 μg/mL之间,最小和最大EC50值相差60倍,平均EC50值为(0.191 2±0.030 0) μg/mL。

表2 龙滩珍珠李炭疽菌菌株对吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺三种杀菌剂的敏感性(菌丝生长速率法)Table 2 Sensitivity of the Colletotrichum spp. from Longtan pearl plum to three fungicides pyraclostrobin, difenoconazole and prochloraz(mycelial growth rate method)

由表2可知,吡唑醚菌酯对供试的26株珍珠李炭疽菌的EC90值介于0.546 4～136 694.669 8 μg/mL之间,最小和最大EC90值相差250 173倍,平均EC90值为(6 332.957 0±5 241.016 0) μg/mL;苯醚甲环唑对供试26株珍珠李炭疽菌的EC90值介于2.756 6～1 599.241 3 μg/mL之间,最小和最大EC90值相差580倍,平均EC90值为(135.074 2±65.929 4) μg/mL;咪鲜胺对供试的26株珍珠李炭疽菌的EC90值介于0.066 8～7.665 1 μg/mL之间,最小和最大EC90值相差580倍,平均EC90值为(1.941 8±0.420 5)μg/mL。

2.2 珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性频率分布

从供试菌株对三种杀菌剂的敏感性频率分布(图1)可知,供试的26株炭疽菌对吡唑醚菌酯的敏感性频率(图1A)出现2个明显的峰,有84.6%的菌株(22/26)集中位于第1个峰附近,说明供试菌株对吡唑醚菌酯主要表现为敏感,但有15.4%的菌株(4/26)集中位于第2个峰附近,说明供试菌株对吡唑醚菌酯敏感性下降;供试的26株炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性频率(图1B)呈连续单峰曲线分布,有92.0%的菌株(24/26)集中位于相应的主峰范围内,说明供试菌株对苯醚甲环唑主要表现为敏感,但也存在少数敏感性较低的菌株;供试26株炭疽菌对咪鲜胺的敏感性频率(图1C)呈连续单峰曲线分布,有92.3%的菌株(24/26)集中位于相应的主峰范围内,说明供试菌株对咪鲜胺主要表现为敏感,但也存在少数敏感性较低的菌株。

图1 供试珍珠李炭疽病菌对吡唑醚菌酯(A)、苯醚甲环唑(B)和咪鲜胺(C)的敏感性频率分布Fig.1 Frequency distribution of EC50 values of Colletotrichum spp.from pearl plum to pyraclostrobin (A), difenoconazole (B) and prochloraz (C)

2.3 不同种珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性

从表3可以看出,吡唑醚菌酯对21株C.fructicola的EC50值介于0.058 3～84.566 0 μg/mL之间,平均EC50值为(7.441 4±4.345 0)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较大;3株C.gloeosporioides的EC50值介于0.322 6～1.814 5 μg/mL之间,平均EC50值为(1.139 4±0.436 5)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较大;1株C.cigarro的EC50值为1.692 3 μg/mL;1株C.siamense的EC50值为1.803 7 μg/mL,根据EC50值可得,供试的四种珍珠李炭疽菌种间对吡唑醚菌酯的敏感性差异不显著。苯醚甲环唑对21株C.fructicola的EC50值介于0.165 8～2.168 0 μg/mL之间,平均EC50值为(0.758 9±0.100 2)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较小;3株C.gloeosporioides的EC50值介于0.216 4～0.646 1 μg/mL之间,平均EC50值为(0.424±0.124 3)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较小;1株C.cigarro的EC50值为0.381 3 μg/mL;1株C.siamense的EC50值为1.280 9 μg/mL,根据EC50值可知,供试的四种珍珠李炭疽菌种间对苯醚甲环唑的敏感性差异不显著。咪鲜胺对21株C.fructicola的EC50值介于0.010 8～0.599 4 μg/mL之间,平均EC50值为(0.169 7±0.027 7)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较小;3株C.gloeosporioides的EC50值介于0.119 1～0.359 1 μg/mL之间,平均EC50值为(0.229 6±0.069 9)μg/mL,种内菌株的敏感性差异较小;1株C.cigarro的EC50值为0.072 9 μg/mL;1株C.siamense的EC50值为0.645 2 μg/mL,根据EC50值可知,供试的四种珍珠李炭疽菌种间对咪鲜胺的敏感性差异较大,其中C.siamense与其他三个种种间菌株的敏感性差异较显著(P<0.05),但另外三个炭疽菌种间菌株的敏感性差异不显著。

表3 不同种珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性Table 3 Sensitivity of different species of Colletotrichum spp.of pearl plum to three fungicides pyraclostrobin, difenoconazole and prochloraz

2.4 不同地区珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性

从表4可看出,同一地区内的菌株对吡唑醚菌酯的敏感性差异较大。天峨县八腊乡的菌株间敏感性差异较大,差异倍数达到1 450.5;其次为天峨县坡结乡的菌株,差异倍数为127.4;而独山县本寨乡菌株的差异倍数仅为1.4;天峨县下老乡和天峨县向阳镇的菌株间差异倍数分别是2.4和3.1。通过比较不同地区菌株对吡唑醚菌酯的敏感性指数可以发现,天峨县向阳镇、天峨县纳直乡、天峨县下老乡、平塘县掌布景区和独山县本寨乡菌株的敏感性明显低于平均水平;天峨县八腊乡和天峨县坡结乡菌株的敏感性高于平均水平,对吡唑醚菌酯的敏感性指数>1,存在潜在的抗药性风险。

表4 不同地区珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性Table 4 Sensitivity of Colletotrichum spp.of pearl plum from different regions to three fungicides pyraclostrobin, difenoconazole and prochloraz

同一地区内的菌株对苯醚甲环唑的敏感性差异较大。天峨县八腊乡的菌株间敏感性差异较大,差异倍数达到13.1;而天峨县下老乡菌株的差异倍数仅为1.1;天峨县坡结乡、天峨县向阳镇和独山县本寨乡菌株间的差异倍数在1.3～1.6之间。通过比较不同地区菌株对苯醚甲环唑的敏感性指数可以发现,天峨县坡结乡、天峨县纳直乡和天峨县下老乡的菌株敏感性明显低于平均水平;天峨县向阳镇的菌株敏感性处于平均水平;天峨县八腊乡、平塘县掌布景区和独山县本寨乡的菌株敏感性高于平均水平,对苯醚甲环唑的敏感性指数>1,存在潜在的抗药性风险。

同一地区内的菌株对咪鲜胺的敏感性差异较大。天峨县八腊乡的菌株间敏感性差异较大,差异倍数达到55.5;而天峨县下老乡和独山县本寨乡菌株的差异倍数仅为1.2,天峨县坡结乡菌株的差异倍数仅为1.5;天峨县向阳镇菌株间的差异倍数为4.2。通过比较不同地区菌株对咪鲜胺的敏感性指数可以发现,天峨县纳直乡、天峨县下老乡、平塘县掌布景区和独山县本寨乡菌株的敏感性明显低于平均水平;天峨县坡结乡和天峨县向阳镇的菌株敏感性处于平均水平;天峨县八腊乡的菌株敏感性高于平均水平,对咪鲜胺的敏感性指数>1,存在潜在的抗药性风险。

3 讨 论

目前化学防治仍是防治珍珠李炭疽病的重要手段,但关于珍珠李炭疽病原对常用化学药剂的敏感性研究较少。本研究首次采用菌丝生长速率法测定采自广西和贵州省共23个果园的龙滩珍珠李炭疽菌对吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺三种常用杀菌剂的敏感性,为龙滩珍珠李炭疽病的化学防治提供了参考。供试26株珍珠李炭疽菌整体对以上三种杀菌剂敏感,且对咪鲜胺的敏感性最高,EC50平均值为(0.191 2±0.03) μg/mL;对苯醚甲环唑的敏感性次之,EC50平均值为(0.725 8±0.088) μg/mL;对吡唑醚菌酯的敏感性最低,EC50平均值为(6.276 3±3.525 5) μg/mL。

唐利华等[35]研究发现珍珠李炭疽病的药剂筛选试验表明咪鲜胺、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯在室内毒力测定和田间防治试验中均表现出较好的效果。国内外大部分作物炭疽菌对吡唑醚菌酯表现为敏感[13-15],但已发现苹果炭疽菌[16-17]、草莓炭疽菌[18]等均对吡唑醚菌酯产生抗药性,本研究也发现部分珍珠李炭疽菌对吡唑醚菌酯敏感性下降,且不同种菌株对同一类型杀菌剂敏感性也存在差异。国内外已报道的梨树、葡萄、草莓等作物炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性存在显著差异[25-26],而本研究只发现极少数珍珠李炭疽菌菌株对苯醚甲环唑敏感性下降,表明苯醚甲环唑仍然可以用作珍珠李炭疽病的防治药剂合理使用。珍珠李炭疽菌对咪鲜胺表现最为敏感,但同一地区不同菌株对咪鲜胺敏感性差异倍数最大,抗药性群体产生的风险较大。

不同种的珍珠李炭疽菌对三种杀菌剂的敏感性各不相同。四种炭疽菌对苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯的药剂敏感性差异不显著,这与韩永超等[29]对湖北草莓炭疽菌对苯醚甲环唑敏感性测定和郭堂勋等[23]对中国芒果炭疽菌复合种对吡唑醚菌酯敏感性测定的结果一致。四种炭疽菌对咪鲜胺的药剂敏感性差异显著,其中暹罗炭疽菌与其他三个种间的敏感性差异较显著,另外三个炭疽菌种间的敏感性差异不显著,结果与韩永超等[22]对湖北草莓炭疽菌对咪鲜胺敏感性测定的结果一致。

不同地理来源的珍珠李炭疽菌和同一地区不同菌株对三种杀菌剂的敏感性存在显著差异,可能与所在地区农药的使用量及使用年限有关[26]。由于样本数量有限,而且受很多因素的影响,药剂在培养皿内的抑菌活性与田间植物上的作用效果可能不完全一致。很多杀菌剂复配对炭疽菌可以起到增效作用[36],但珍珠李炭疽菌对混合复配杀菌剂的敏感性,是否与单一药剂相似,需要进一步研究。

在珍珠李炭疽病的化学防控上,果农普遍存在技术和方法不到位的问题。主要是重治轻防,盲目施药,发病较严重后才打药。为了有效防控珍珠李炭疽病,综合考虑各种发病因素,建议采取农业防治、生物防治、化学防治等多种方法相结合的综合防控措施,有效降低病原菌抗药性的产生。一是采收后秋冬要进行清园,清除病残体减少病原初侵染来源;二是适时进行化学药剂防治,开花期、嫩叶期和大雨前后要轮换交替用药[37],避免病原菌产生抗药性,保障珍珠李产业的健康可持续发展。