咪鲜胺降解菌群的富集及降解特性研究

刘 霞，胡世珊，吴晓玉，王 飞*

(1.南昌理工学院新能源与环境工程学院，江西南昌330000；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045)

咪鲜胺(Prochloraz，1-N-丙基-N-[ 2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]-氨基甲酰咪唑)是英国Boots公司于1974年首先合成的一种高效广谱的咪唑类杀菌剂，在正常贮存条件及碱性条件下均比较稳定，但对日光不稳定[1]。咪鲜胺抑菌的机制为抑制麦角甾醇生物合成，对多种作物子囊菌和半知菌病害有显著防效[2]。广泛应用于防治各种作物及林业的真菌病害[3-7]，也用于种子、苗木处理及水果贮存期的病害[8-9]。国内学者对咪鲜胺进行药效试验证实咪鲜胺对Sclerotiniasclerotiorum引起的油菜菌核病[10]、Mycosphaerellamusicola引起的香蕉叶斑病[11]、Penicilliumdigitatum引起的柑橘采后霉腐[12]、Melampsoralini引起的亚麻锈病[13]等都有明显功效，且用量较低。

自咪鲜胺开发应用以来，国内外就其残留代谢与环境毒理方面进行了深入的研究。长期过量使用咪鲜胺后，残留的药物在植株、果实、土壤产生一定量的沉积，通过淋滤作用进入水体后，对农业生态环境和人类健康都构成较大威胁[14]。咪鲜胺在环境中的降解,首先是降解成单个或结合态的N-丙基-N[2-(2,4,6-三氯苯氧基) 乙基] 脲(BTS 44595) 和N-醛基-N-丙基-N[2-(2,4,6-三氯苯氧基) 乙基]脲(BTS 44596) 。BTS 44595 和BTS 55596 最后降解成2,4,6- 三氯苯酚[1,14]。而咪鲜胺降解的中间代谢产物2,4,6-三氯苯酚对蝌蚪的毒性远大于其它代谢产物[15]，同时，2,4,6-三氯苯酚还会干扰抗雄激素性的性别分化[16-17]。

咪鲜胺自身在环境中的代谢降解较缓慢，研究表明，微生物是土壤和水环境中的有害化合物的降解的主力。采用生物法修复咪鲜胺所造成的环境污染，以及清除果蔬、农产品上的农残，具有条件温和，成本低，效率高，无二次污染等优势。当前对咪鲜胺降解的研究大多集中在自然降解过程，对微生物降解的途径和分子机制的研究尚无报道。因此，分离筛选出能高效降解咪鲜胺的微生物资源，通过对其生物降解途径中关键降解酶的解析，对咪鲜胺污染的修复具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 无机盐培养基MSM(g/L)：NaCl 1.0，K2HPO41.5，NH4NO31.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，去离子水1 000 mL；pH 7.0～7.2。121 ℃、灭菌20 min。LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0；pH 7.0～7.2；121 ℃，灭菌20 min。固体LB培养基：液体LB培养基中加入15.0 g琼脂粉。

1.1.2 试剂 咪鲜胺原药(>95%)，由正邦集团江西分公司李强先生馈赠，Tris、HCl、NaOH、二氯甲烷、酵母粉、蛋白胨、NaCl、K2HPO4、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、无水硫酸钠均为分析纯，购至江西必优科技有限公司。pMD19-T载体，Taq酶，T4 DNA ligase，限制酶等均购于TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咪鲜胺紫外吸收光谱扫描 用电子天平准确称取咪鲜胺标准品1 g，用适量的甲醇溶液溶解，25 ℃定容至100 mL，制得10 000 mg/L的储备母液，备用。

取100 μL咪鲜胺母液，加入至20 mL无菌水，配制成浓度为50 mg/L的咪鲜胺溶液，以等体积二氯甲烷萃取，静置分层后，取下层二氯甲烷溶液加入少量无水硫酸钠去除残留的水份；于200～400 nm波长下进行紫外光谱扫描，确定最高吸收峰值。

1.2.2 咪鲜胺标准曲线的绘制 将咪鲜胺母液用无机盐培养基稀释成不同的浓度：10，20,30,40,50 mg/L，在最大吸收峰波长下测定OD值，以OD228为纵坐标，以咪鲜胺浓度为横坐标作标准曲线。

1.2.3 降解菌群的富集 从安义、南丰等柑桔园区长期受咪鲜胺污染的地区采集土样，取5 g接种到含有20 mg/L咪鲜胺的100 mL无机盐培养基中，于30 ℃，150 r/min摇床振荡培养7 d。每天检测降解效果并于600 nm波长下测定生物量，7 d后取第一代的富集液5 mL，转接至含50 mg/L咪鲜胺的100 mL无机盐培养基中；7 d后取第一代的富集液5 mL，转接至含100 mg/L咪鲜胺的100 mL无机盐培养基中共转接三代[18]。

1.2.4 初始pH对富集液降解咪鲜胺的影响 在250 mL的三角瓶中分别装入100 mL的无机盐培养基，并且将无机盐培养基的初始pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入50 mg/L的咪鲜胺，将第三代的富集液以5%的接种量接入无机盐培养基中，于30 ℃，180 r/min摇床振荡培养，每12 h取样，用紫外分光光度计测定咪鲜胺的残留量，计算降解率。

降解率=(对照农药浓度-降解菌处理后农药浓度)/对照农药浓度×100%。

1.2.5 咪鲜胺初始浓度对富集液降解能力的影响 在250 mL的三角瓶中分别装入100 mL的无机盐培养基中，加入初始咪鲜胺终质量浓度为20，50，100，150，200 mg/L，将第三代的富集液按5%接种量接入无机盐培养基中，于30 ℃，180 r/min摇床振荡培养，每12 h取样测定咪鲜胺的残留量，用紫外分光光度计测定降解效果。计算降解率，确定咪鲜胺初始浓度对菌株降解咪鲜胺的影响。

1.2.6 接种量对富集液降解能力的影响 在250 mL的三角瓶中分别装入100 mL的无机盐培养基中，加入咪鲜胺终浓度50 mg/L，将第三代的富集液按0%、1%、2%、3%、5%接种量接入无机盐培养基中，于30℃，150 r/min摇床振荡培养，每12 h取样测定咪鲜胺的残留量，用紫外分光光度计测定降解效果。计算降解率，确定接种量对菌株降解咪鲜胺的影响[19]。

1.2.7 咪鲜胺降解富集液菌落结构分析 高盐沉淀法提取降解菌群总DNA，以咪鲜胺菌群总DNA为模板，利用16S rRNA基因的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，扩增体系如下：2×GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 5 μL，Mg2+4 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq酶0.5 μL加ddH2O 12.5 μL。反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，进行30个循环；10 ℃降温结束反应。PCR产物于0.75%琼脂糖凝胶回收纯化后TA克隆至pMD19-T。以阳性克隆为模板，以M13-47和RV-M引物扩增pMD-19T载体上插入的16S rDNA片段。引物序列为：M13-47：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′；RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。PCR产物纯化后，采用限制酶RsaⅠ和HhaⅠ分别酶切16S rDNA[19]。酶切产物使用2%琼脂糖凝胶电泳。根据两种酶切产物电泳图筛选出同型条带，送相应转化子的LB培养物至杭州祥音生物技术有限公司测序，分析菌群结构。

2 结果与分析

2.1 咪鲜胺紫外光谱扫描

将含有50 mg/L咪鲜胺的无机盐培养基以二氯甲烷萃取，在200～400 nm波长下进行紫外光谱扫描，结果见图1。咪鲜胺标准品在228 nm处有一最大吸收峰。此外在279 nm和288 nm处也有两个不明显的小峰，确定228 nm为检测咪鲜胺的波长。

图1 咪鲜胺紫外扫描图谱Fig.1 UV spectrum scanning of prochloraz

配制质量浓度分别为10，20，30，40，50 mg/L的咪鲜胺溶液，在228 nm处测定吸光度，以咪鲜胺浓度为横坐标，以OD228为纵坐标，绘制咪鲜胺标准曲线。所得线性方程为y=0.040x-0.372，R2=0.997，该方程可以满足咪鲜胺检测需要。

2.2 咪鲜胺降解微生物群落的富集驯化

土样经过传代富集培养之后，取第3代的培养物，每天测定生物量，二氯甲烷萃取后进行紫外扫描。计算不同时段咪鲜胺的降解率，绘制生物量-降解率的关系图，见图2。

从图2可知，富集液在第7天时可将50 mg/L的咪鲜胺基本降解完全，随着咪鲜胺的降解，生物量也逐渐提高，表明富集液中的微生物菌群可以咪鲜胺为唯一碳源进行生长。

图2 富集液降解咪鲜胺的效率与生物量变化曲线Fig.2 Degradation curve of prochloraz by the consortium M3

图3 初始pH对富集液降解能力的影响Fig.3 Effect of pH on degradation of prochloraz by the consortium M3

2.3 初始pH值对富集液降解能力的影响

配制不同pH值的培养基，按1%接种量接种第3代富集液后，定时检测咪鲜胺残留量，绘制时间-残留率图，见图3。

由图3可以看出，富集液在pH 8.0时对咪鲜胺的降解最好，36 h的降解率就达到了50%，在pH 7.0～9.0内均有降解效果，这说明富集液中的菌群可以在大多数偏碱性的环境中发挥降解作用。然而富集液在酸性条件下的降解率比较低，在pH5.0时5 d后的降解率只有不到10%，这有可能是在酸性条件下限制了降解菌株的生长。

2.4 咪鲜胺初始浓度对富集液降解能力的影响

按1%接种量接种第3代富集液至初始浓度分别为20，50，100，150，200 mg/L咪鲜胺的无机盐培养基中，定时取样检测咪鲜胺残留量，结果见图4。

咪鲜胺的初始浓度对富集液的降解率均有明显的影响，如图4所示，当咪鲜胺初始浓度为50 mg/L时，6 d后残留量仅为15.84%；而当咪鲜胺的初始浓度为200 mg/L时，其残留量为88.82%，因此咪鲜胺的最适初始浓度20 mg/L。从图中可以看出,富集液对较低浓度的咪鲜胺有较好的降解效果，当咪鲜胺浓度超过100 mg/L时，富集液的降解效果显著下降，这可能是由于过高浓度的咪鲜胺对富集液产生毒害作用，或者是降解过程中的中间代谢产物对微生物菌群有毒害作用而抑制其生长，从而会影响富集液的降解能力。

图4 咪鲜胺初始浓度对富集液降解效果的影响Fig.4 Effect of prochloraz concentration on degradation of prochloraz by the consortium M3

图5 接种量对富集液降解能力的影响Fig.5 Effect of inoculums on degradation of FE prochloraz by the consortium M3

2.5 接种量对富集液降解能力的影响

分别以0%，1%，2%，3%，5%的接种量接种第3代的富集液至含50 mg/L咪鲜胺的无机盐液体培养基中，每天取样测定咪鲜胺残留量，计算残留率，绘制接种量-残留率的分时降解曲线，结果见图5。

如图5所示，当咪鲜胺初始浓度为50 mg/L时，富集液接种量为3%和5%时，5 d后残留率几乎达到了零，即使接种量较低即1%和2%时也能达到较好的降解效果，残留率达到了20%左右。5%的接种量则可以在5 d内降解效率达到90%以上，所以，接种量的高低与农药的降解效率有直接的关系，接种量越大，咪鲜胺的降解效率越高。该结果进一步证明了该富集液对咪鲜胺有较强的降解能力。

2.6 咪鲜胺降解菌群菌种鉴定

以富集液总DNA为模板，扩增16S rDNA后，构建16S rDNA文库，经限制性酶切图谱(RFLP分型)，将优势菌株16S rDNA测序，所测序列于NCBI数据库中，以blastn程序进行序列比对，得到咪鲜胺降解菌富集液中优势菌种如表1，经分析鉴定，富集液中多为稀少菌种及未培养菌。

表1 咪鲜胺降解菌群富集液中优势菌种类

3 讨论

咪鲜胺作为一种广谱杀真菌剂，广泛应用于土传真菌病害防治及果实保鲜等。其主要代谢产物2,4,6-三氯苯酚对摇蚊幼虫、蚯蚓等均有危害[20]。在自然条件下，降解缓慢，但当前对其生物降解的研究少见报道。Bock等[21]以2,4,6-三氯苯酚为唯一碳源，分离得到的菌株Aureobacteriumsp.C964可以降解2,4,6-三氯苯酚，但不能降解咪鲜胺。此外，菌株AlcaligeneseutrophusTCP，RalstoniaeutrophaJMP134也可降解2,4,6-三氯苯酚，但并未发现它们可以从头降解咪鲜胺[22-23]。

由于三氯苯酚具有极强的水溶性，经二氯甲烷萃取，紫外扫描检测时，三氯苯酚存在于水相，因此对紫外扫描法检测的干扰较小，本研究建立的紫外扫描方法可以快速对残留的咪鲜胺进行检测[24-25]。

咪鲜胺等咪唑类化合物含有 1 个含氮杂环，其杂环上的氮原子可与甾醇 14α-脱甲基酶P450(CYP51)的血红素-铁活性中心以配位键结合，从而抑制酶的活性。CYP51 是麦角甾醇生物合成途径中的关键性酶，一旦其活性受到抑制，会阻碍麦角甾醇的合成导致真菌细胞膜结构破坏和细胞死亡[26]。细菌细胞膜不含麦角甾醇，没有咪唑类化合物作用的靶点，从而可以进化出对该类化合物的降解途径。在CupriavidusnecatorJMP134降解2,4,6-三氯苯酚的过程中，2,4,6-三氯苯酚降解的起始步骤为氧化脱氯，通过依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的2,4,6-三氯苯酚单加氧酶(TcpA)催化底物生成2,6-二氯对苯醌；随后2,6-二氯对苯醌继续在TcpA的作用再经水解脱氯生成6-氯-2-羟基对苯醌；6-氯-2-羟基对苯醌在还原酶(TcpB)的作用下生成6-氯-偏苯三酚；6-氯-偏苯三酚经氧化开环生成2-氯马来酰醋酸，最终转化为β-酮己二酸而进入三羧酸循环[27]。

本文以长期受咪鲜胺污染的土壤为材料，在以咪鲜胺为唯一碳源的无机盐培养基中进行富集和驯化，获得一组微生物菌群，该菌群可以在6 d内将50 mg/L的咪鲜胺降解完全。富集液在培养基初始pH 7.0～9.0均有降解效果，在pH 5.0时5 d后的降解率只有不到10%，最适降解pH为8.0；当咪鲜胺初始深度为20 mg/L时，降解完全只需要3 d，当初始浓度为50 mg/L时，降解完全时间为6 d，当初始浓度升高至100 mg/L以上时，降解缓慢；富集液的接种量对降解效果有显著影响，当接种量为5%时，5 d后降解效率达90%以上，接种量为1%时，5 d降解效率仅为80%。

通过构建咪鲜胺降解菌群16S rDNA文库对该菌群结构进行分析，发现该富集液具有丰富的菌种多样性，从16S rDNA文库中已知的优势菌株来看，Sphingobacterium，Pseudomonas以及Methylobacterium菌属大多具有污染物降解能力[19,28-30]，这些菌株可能参与了咪酰胺的生物降解进程，但需要单菌降解实验来验证。