外泌体在牙科正畸治疗中的应用研究

姜可 王权炳 顾京柯 陈虹

正畸治疗即通过各种矫正装置来调整面部骨骼、牙齿及颌面部的神经和肌肉之间的协调性，达到口颌系统平衡、稳定和美观的目的。正畸牙齿移动（orthodontic tooth movement，OTM）是达到矫治目标的重要手段，通过对牙齿施加机械力，引起牙周膜和牙槽骨发生必要的变化[1]。在正畸力的作用下，牙周膜局部血管和微环境发生变化，如炎症因子和活性生物因子的释放、血管变化、细胞形变等，从而引起复杂的生物学级联反应，导致骨吸收和骨重塑，最终实现OTM。此过程中的炎症反应是由机械力而非细菌引起，其与组织稳态之间的平衡对正畸治疗效果至关重要。一旦失衡，炎症可能导致牙根吸收和牙周疾病的发生[2]，影响正畸疗效。因此如何有效和安全地加速OTM，减少治疗过程中由炎症引起的不良后果，快速实现良好且稳定的治疗效果，是正畸医生工作的目标和研究的重点。外泌体是一类由细胞分泌的包含复杂生物活性物质的纳米囊泡，可治疗多种炎症性疾病，并促进骨再生。这种来源广泛且安全性好、作用效率高的外泌体为正畸骨改建及炎症控制提供了新的思路和方法[3]。本文就外泌体在正畸治疗中的应用、优势及可行性等作一综述，以期为临床提供参考。

1 外泌体简介

外泌体是一类直径为30～150 nm 具有脂质双分子层膜结构的细胞外纳米囊泡[4]。1983 年，Johnstone 等[5]在研究网织红细胞成熟时首次发现了外泌体，并于1987 年将其命名为“exosome”。外泌体可由多种细胞分泌而来，也可从生物体液（血液、尿液、唾液等）中分离出来[6]。目前，从生物体液和体外细胞培养中分离纯化外泌体的技术有差速离心、尺寸分离、外泌体沉淀法等，其中差速离心法是目前应用最广泛、最基本的分离方法[7-10]。外泌体中含有多种具有生物活性的RNA、miRNA、DNA 和蛋白质，以旁分泌机制在细胞、组织和器官之间传递生物分子信息[11]，是细胞信号传导的重要介质[12]，介导了细胞间通信和大分子传递，从而发挥生理和病理作用；外泌体通常含有4 种跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81 和CD82）、热休克蛋白、脂蛋白和一些转运相关蛋白，这些蛋白不仅可以为外泌体的鉴定提供标记，还可以在特定的靶细胞中定位外泌体[13]。外泌体带有亲代细胞的理化性质，又具有极高的生物相容性，同时也可以作为药物的有效载体，如利用纳米技术可将小分子或药物装载到外泌体中进行疾病的靶向治疗[14]，是近10 年来生命科学领域发展最为迅猛的研究方向之一。

2 外泌体在正畸治疗中的作用

2.1 外泌体在OTM 中的骨改建作用 OTM 与生理性牙齿移动机制不同，主要指在正畸力作用下牙周组织发生一系列生物学改建，并导致牙周膜和牙槽骨的重塑[15]。当正畸力加载到牙齿上时，牙周膜内的细胞、细胞外基质等受到力的刺激导致促炎介质（如IL-6、IL-8、TNF-α 等）的释放，这些介质在压力和张力部位引起骨吸收和沉积，进而发生OTM[16]。正畸治疗正是利用体内牙槽骨改建的动态平衡移动牙齿，进而纠正错（牙合）畸形。破骨细胞和成骨细胞是参与OTM 的主要成员，其中破骨细胞是一种特殊的终末分化细胞，主要功能是降解骨量和吸收骨基质，它与成骨细胞在功能上相互对应，协同作用，并维持骨再生平衡。破骨细胞和成骨细胞比例失调时，若破骨细胞相对活跃则容易造成骨质损失，反之骨量会增多[17]。Atsawasuwan 等[18]发现，发生牙齿移动时，龈沟液外泌体中miRNA-29 的表达水平改变，这可能与牙齿运动期间破骨细胞的分化有关。Li 等[19]研究发现，破骨细胞来源外泌体中的miR-214 具有破坏并抑制成骨细胞的功能，并可利用促红细胞生成肝细胞激酶受体相互作用蛋白A2（Eph family receptor interacting protein A2，ephrinA2）/促红细胞生成肝细胞激酶A2（ery-thropoietin producing hepatocyte kinases A2，EphA2）的特点将miR-214/miR-214-3p 精准转移至成骨细胞中，达到降低成骨细胞分化、抑制成骨细胞活性并减少骨形成的作用。这种骨平衡的破坏则加速了正畸过程中牙齿的移动[20]。Huang 等[21]将牙周膜干细胞来源外泌体注射到小鼠体内，结果发现小鼠牙周膜中的破骨细胞比例增加，并促进机械力诱导下牙齿的移动。由此可见，外泌体具有加快OTM、促进OTM 后骨改建的作用，为临床医生提供了新的正畸辅助手段。

2.2 外泌体在快速扩弓中的应用 快速扩弓（rapid maxillary expansion，RME）技术最早于1860 年由Angell提出并将其应用于临床[22]，如今已被广泛应用于上牙弓狭窄、上颌横向发育不足、上颌牙列拥挤、后牙反合等错（牙合）畸形中。在进行RME 时，机械力刺激了腭中缝骨组织的重塑，促进了腭中缝区的成骨活动。但是扩张力解除后，腭中缝组织重塑恢复到正常水平[23]，同时口腔周围神经肌肉功能不稳定，腭骨水平板向腭中线聚集的力量增加，致使一部分新形成的骨组织受到压力而发生吸收，造成复发[24]。目前临床上主要通过矫形过度扩张和长期佩戴保持器等治疗扩弓后的复发，但治疗效果不理想并增加患者不适感。Saito等[25]报道，腭中缝骨再生不足是复发的主要原因。Oztürk 等[26]研究发现双磷酸盐可抑制骨吸收，在快速上颌扩弓后注射双磷酸盐，辅助机械保持可减少扩弓后的复发，但过大剂量的双磷酸盐反而对颌骨的矿化产生一定的障碍。刘青等[27]研究发现槲皮素能够促进大鼠上颌RME 时腭中缝骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 的表达，加速新骨形成并促进骨质沉积钙化，进而防止扩弓后复发，但槲皮素大量摄入后会引起胃肠道反应、关节疼痛和僵硬、体内荷尔蒙水平异常变化等不良反应。Zhao 等[28]将可注射的介孔生物活性玻璃/纤维蛋白胶复合水凝胶使用于快速上颌扩张中，结果发现复发减少且成骨加速。Ekizer 等[29]对模型大鼠的研究发现，相比于对照组，单次局部注射干细胞治疗增加了腭中缝区域的成骨细胞和血管数量，可以在上颌扩张后更快地成骨。随着外泌体相关研究的深入，研究人员发现干细胞来源外泌体具有优异的诱导成骨性能。如骨髓间充质干细胞外泌体可利用miR-196a 正向调节成骨基因表达和成骨细胞分化[30]。Zhai 等[31]研究发现将干细胞外泌体与3D 打印的钛合金支架结合可有效治疗骨缺损，RNA测序表明干细胞外泌体主要通过上调的成骨miRNA（Hsa-miR-146a-5p、Hsa-miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p 和Hsa-miR-129-5p）或下调的抗成骨miRNA（HsamiR-32-5p、Hsa-miR-133a-3p 和Hsa-miR-204-5p）诱导成骨分化，进而激活磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B 通路（protein kinase B，Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路以促进成骨。Li等[32]发现从M2 型巨噬细胞中分离的外泌体可以通过miR-690/胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）/具有盘状同源区域结合序列的转录共活化因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）信号通路促进成骨。据此推测，通过外泌体增加成骨、增强骨再生并促进新的骨质钙化来增加上颌骨扩张稳定性[33-35]，减少正畸RME 后的复发可能是一种临床应用前景较好的潜在方法。

2.3 外泌体在正畸过程中的牙周炎症控制作用 作为正畸治疗的补充，牙周治疗通常在正畸治疗开始前3～6 个月完成，从而减少在正畸治疗期间牙周炎症致牙槽骨吸收、牙齿松动等风险。然而，在固定矫治过程中口腔内通常存在托槽、橡皮链、弓丝等正畸材料，治疗周期较长，食物残渣不易清洁，增加了牙石和菌斑堆积的风险，降低牙龈健康程度以及口腔卫生程度[36]，导致口腔微生物群落结构恶化，进而引起龈炎，表现为牙龈红肿、出血等症状[37-38]。而长期的龈炎得不到改善将形成牙周炎，影响正畸的效果。因此在正畸治疗过程中，牙周炎症的控制尤为重要。Liu 等[39]研究发现骨髓间充质干细胞来源外泌体可能参与骨保护素（osteoprotegerin，OPG）-NF-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）-NF-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）信号通路并抑制破骨细胞的功能，通过诱导巨噬细胞极化来调控炎症免疫反应，从而抑制牙周炎的进一步发展和免疫损伤。籍辰等[40]研究发现在慢性牙周炎小鼠模型中，M1 型巨噬细胞介导的免疫应答增强，提示慢性牙周炎的炎症反应和组织损伤中有M1 型巨噬细胞参与；而牙龈干细胞来源外泌体能够促进炎症状态下的巨噬细胞向M2 型极化，减轻炎症反应[41]。使用外泌体配合牙周炎基础治疗有利于接受正畸治疗的牙周炎患者牙槽骨吸收，为牙周炎患者正畸治疗提供了思路。朱斌等[42]发现骨髓间充质干细胞来源外泌体能显著促进牙周膜干细胞增殖、克隆及成骨。Chew 等[43]利用牙周膜干细胞来源外泌体实现了大鼠缺损牙周组织的牙槽骨再生及功能性牙周膜纤维再生，为牙周组织的再生提供了新的无细胞方法，并可能对因正畸引起的牙龈萎缩起到改善作用。同样，Li 等[44]研究表明牙周膜干细胞来源的外泌体可通过PI3K/Akt 信号通路促进成牙骨质细胞的活性，促进正畸诱导炎症性牙根吸收的修复。可见在正畸过程中协同使用干细胞来源外泌体治疗牙周炎，可达到减轻牙周组织炎症、抑制牙周组织吸收、促进牙周组织再生的作用[45]。

2.4 外泌体在正畸保持阶段的应用 在OTM 期间，移动牙齿根部（张力侧）新形成的骨骼可作为防止复发的初始屏障。如果没有足够长的保留期，刚重塑的牙槽骨因没有完全矿化，无法抵抗间隔纤维引起的复发力，会发生正畸后的复发[46]。因此，促进正畸牙根张力侧新骨的生成及矿化是抑制正畸复发的重点。外泌体诱导钙质沉积、促进骨组织再生修复的性能使其在正畸后的保持阶段依然发挥不容忽视的辅助治疗作用。费栋栋[47]研究表明，牙周膜干细胞来源的外泌体可能通过携带更多的组蛋白赖氨酸乙酰转移酶6A（lysine acetyltransferase 6A，KAT6A）mRNA，介导靶细胞-牙周膜干细胞KAT6A 的表达上调，进而影响其组蛋白乙酰化水平，达到促进靶细胞成骨分化的作用。Xiong 等[48]发现miR-5106 在M2 型巨噬细胞中高度富集，并且通过靶向盐诱导激酶（salt-inducible kinases，SIK）2 和SIK3 基因促进骨髓间充质干细胞成骨细胞分化。刘先博[49]研究发现牙周膜干细胞来源的外泌体可以携带miR-100-5p 通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）调控OTM 局部牙槽骨改建，抑制正畸后的牙齿移动，降低患者正畸后的复发率。Liu 等[50]使用辛伐他汀和牙周膜干细胞来源的外泌体在体外获得装载辛伐他汀的外泌体，并将其应用于OTM 大鼠模型；在复发期间于大鼠的局部牙槽骨注射装载辛伐他汀的外泌体，结果表明外泌体可增加辛伐他汀在患处局部的溶解度，抑制了OTM 大鼠模型正畸后的复发。亦有文献报道来自成熟破骨细胞的外泌体可抑制破骨细胞的形成[51]，从而维持正畸的治疗效果。目前矫正结束后，单纯通过保持器进行正畸术后的保持，大多依赖患者的依从性，而在正畸结束后使用外泌体治疗可加速成骨和骨质成熟，辅助保持器作用，达到减少正畸后复发的效果。

3 小结

随着正畸技术的不断发展，正畸学开始使用细胞和生化信号，不断丰富理论基础，并进行新的临床应用尝试。正畸过程中牙齿的移动、扩弓后及正畸后的保持不能仅依靠于单纯的机械力，外泌体的应用为正畸治疗提供了一种安全、创新、无细胞的辅助手段，这为临床医生提供了新的思路，但外泌体的临床适用性仍然受到限制。因此，需要更多的研究来阐明外泌体在正畸过程中的具体作用、分子机制以及如何将其量化，从而更有效地增强正畸治疗、优化正畸力强度和预防正畸治疗导致的牙周组织损伤等。