改性SiOx/WPU 涂膜对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制作用

杨峻乙，张家涛，2，刘亮军，李秀霞，王莉丽，杨 旭，孙 彤*，励建荣

（1 渤海大学食品科学与工程学院 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁锦州121013 2 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018 3 民泽龙羊峡生态水殖有限公司 青海海南藏族自治州 811800）

细菌生物被膜（Biofilm，BF）是一种复杂的细菌聚集膜，由细菌分泌的胞外多糖、纤维蛋白、脂质蛋白等物质组成，是地球上分布最广、最成功的生命模式，被定义为“微生物的聚集体”，是细菌生长过程中形成的一种天然保护状态[1-2]。物体表面99.9%的细菌以生物被膜形式存在[3]。生物被膜使菌体成为结构复杂的高度组织化群体，其形成包括黏附期、生长期、成熟期、分散期4 个阶段的动态过程[1，4]，对细菌菌体具有强烈的保护作用。

1997 年，Neinhuis 等[5]和Barthlott 等[6]发现，植物表面的微观结构粗糙度及表皮蜡的疏水特性的结合使植物具有自清洁和超疏水性能，称之为“莲花效应”。基于生物界的这种发现，人们制备出水接触角大于150°，滚动角小于10°的超疏水表面，具有低表面能和特殊的浸润性，能够有效减少细菌细胞与材料表面之间的黏附[7-8]。由于超疏水表面具有独特的浸润性能，使其在自清洁、抗细菌黏附、防冰、油水分离等领域有广泛的应用前景[9]。然而，有研究表明，超疏水表面长期暴露于潮湿环境后仍有被浸润的风险，随着时间的推移，细菌会在材料表面附着，使其失去抗菌性能，这种现象在超疏水材料表面较为常见[7，10]。基于此，人们通过对超疏水表面制备原理的认识与研究，制备出超双疏表面，然而其在实际应用中的范围较窄，这是由于其表面性能不太稳定[11-12]。

纳米SiOx 是一种无毒、无味的无机非金属材料，易制备、易改性、粒径可控，可作为抗拮剂加入脱水蛋制品、饮料、乳制品等食品中[13-15]。聚氨酯（Polyurethane，PU）是一种新兴高分子聚合物，其链段结构由软段和硬段交替构成，且主链中含有氨基甲酸酯（-NHCOO-）结构单元[16]。水性聚氨酯（Waterborne polyurethane，WPU）是以水代替有机溶剂为分散相的二元胶态体系，无毒、无污染，在纺织、皮革、涂层、生物医药等领域被广泛应用[17-18]。水性聚氨酯涂料化学性质稳定，无毒、无味，是一种环保型高分子聚合物弹性防水材料[19]。

腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）为耐冷革兰氏阴性菌，能够还原氧化三甲胺（TMAO）产生硫化氢、三甲胺（TMA）及氨基酸代谢产物等，易黏附于材料表面，从而形成生物被膜，有很强的致腐能力，是一种典型的水产品优势腐败菌[20-22]。

本文采用Stöber 法在同一溶剂体系中制备和改性SiOx 微纳米粒子，然后以水性聚氨酯为成膜材料，制备改性SiOx/WPU 涂膜。研究该涂膜对水产品中腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制机制，以拓宽超双疏涂膜在食品保鲜领域的应用，并提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

疏水气相纳米SiOx 颗粒、微米级SiOx 颗粒，上海凛恩科技发展有限公司；腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，ATCC 8071）为渤海大学食品安全实验室保存；超微量Na+/K+-ATP 酶测定试剂盒、碱性磷酸酶（AKPase）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；考马斯亮蓝试剂盒，国药集团化学试剂有限公司；去离子水为实验室自制，电导率〈15 μS/cm；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（型号：FA2204C），上海天美天平仪器有限公司；磁力搅拌器（型号：SN-MS-3D），上海尚普仪器设备有限公司；真空干燥箱（型号：DZF-1B），鄄城威瑞科教仪器有限公司；场发射扫描电镜（型号：S-4800），日本日立公司；原子力显微镜（型号：XE-70），韩国Park Systems 公司；差示扫描量热仪（型号：Q2000），上海蔡睿科学仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（型号：Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer），美国安捷伦公司；X 射线粉末衍射仪（型号：Rigaku Ultima IV），日本理学株式会社；视频光学接触角测量仪（型号：OCA 25），德国数据物理仪器有限公司；X 射线光电子能谱仪（XPS）（型号：Thermo Scientific K-Alpha），赛默飞世尔科技公司；鼓风干燥箱（型号：DHA-9423A），上海精宏实验设备有限公司；立式高压灭菌锅（型号：MLS-3030CH），日本三洋有限公司；生化培养箱（型号：LRH-150），上海一恒科技有限公司；台式恒温振荡箱（型号：THZD），太仓市实验设备厂；酶标仪（型号：Victor X3），上海珀金埃尔默仪器有限公司。

1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的制备及表征

1.3.1 改性SiOx/WPU 涂膜的制备 将0.2400 g CTAB、24.00 mL 无水乙醇和3.00 mL 氨水（28%）依次加入24.00 mL 去离子水中，搅拌溶解后逐滴加入3.00 mL 正硅酸乙酯（TEOS），常温继续搅拌3 h，得SiOx 混悬液。过滤混悬液并用去离子水和无水乙醇分别洗涤滤渣3 次，滤渣在60 ℃，0.6 MPa 条件下真空干燥2 h，得C-SiOx 颗粒。

分别取0.3000 g 的气相纳米SiOx 颗粒、微米级SiOx 颗粒和C-SiOx 颗粒与30.00 mL 无水乙醇超声后的悬浊液，逐滴加入3.00 mL 的TEOS 后依次加入6.00 mL 氨水（28%）和300 μL1H，1H，2H，2H-全弗辛基三氯硅烷（PFOTS），室温条件下搅拌6 h，再次加入150 μL PFOTS，室温条件下继续搅拌2 h，反应结束后过滤，并用10.00 mL 无水乙醇洗涤滤渣，重复3 次，随后在55 ℃，0.6 MPa的条件下真空干燥2 h，分别得改性气相纳米SiOx颗粒、改性微米级SiOx 颗粒和C-SiOx 颗粒。

将4.0%（m/V）的改性SiOx 颗粒与0.1800 g WPU、2.30 mL 无水乙醇和2.70 mL 乙酸乙酯超声混合溶液在室温条件下搅拌1 h，得改性SiOx/WPU 涂膜液。采用滴涂法在5 cm×5 cm 的聚氯乙烯（PVC）薄片上滴涂1.20 mL 的涂膜液，室温晾干后，于55 ℃烘箱烘干6 h，得改性SiOx/WPU 涂膜。

1.3.2 SiOx 颗粒及涂膜的表征分析 采用场发射扫描电子显微镜（SEM）观察改性SiOx 颗粒及改性SiOx/WPU 涂膜的微观结构。喷金条件为：20 kV，3 min；测定电压为：1.5 kV 或1.0 kV。

在40 kV，50 mA，CuKα 辐射，步宽0.02°，扫描范围5°～40°条件下，采用X 射线粉末衍射仪（XRD）对改性SiOx 微纳米粒子及改性SiOx/WPU涂膜样品进行晶型分析。

采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对改性后的SiOx 颗粒进行FT-IR 光谱扫描，波长范围为4 000～500 cm-1，步宽为2 cm-1。

将滴涂有改性SiOx/WPU 涂膜的PVC 薄片裁成5 mm×5 mm 大小，在15 kV 和150 W 的条件下，以与样品表面呈90°的起飞角收集光电子，采用X 射线光电子能谱（XPS）对样品进行元素分析。

SiOx/WPU 涂膜表面的3D 轮廓形貌及其平均粗糙度采用原子力显微镜（AFM）进行表征。

称取3～8 mg 样品，采用差示扫描量热仪（DSC）测定涂膜的热稳定性，测定条件：升温速率为10.00 ℃/min，升温范围为20～250 ℃，氮气环境。

称取5～10 mg 样品，采用热重分析仪（TGA）在20.0 mL/min 的氮气流量，10.00 ℃/min 的加热速率下测定涂膜的热稳定性，测定温度范围为30～650 ℃。

1.3.3 浸润性能和表面能测定 参考《纳米材料超双疏性能检测方法》（GB/T 26490-2011）[23]，测定改性SiOx/WPU 涂膜的水接触角和正十六烷接触角。用Owens-Wendt-Rabel-Kaelble（OWRK）法计算表面自由能[24]。

1.4 腐败希瓦氏菌生物被膜相关指标测定

1.4.1 涂膜表面腐败希瓦氏菌生长曲线的测定 取在28 ℃、OD595nm值约为0.5 的腐败希瓦氏菌菌悬液中培养一定时间的涂膜，用1 mL 无菌PBS 溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，以除去其表面的浮游菌，随后将涂膜置于装有10 mL 无菌PBS 的离心管中，224 W 53 kHz 超声处理10 min，以剥离涂膜表面的生物被膜。取1 mL 超声后的菌悬液加入到9 mL 无菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）中进行10倍梯度稀释，按照GB 4789.2-2016 的方法进行平板计数[25]。

1.4.2 涂膜表面腐败希瓦氏菌生物被膜的微观结构观察 取培养4，12，24 h 后的涂膜，超声剥离生物被膜，在4 ℃，3 000×g 条件下离心10 min，弃去上清液，立即加入1 mL 2.5%（体积分数）戊二醛溶液固定2 h。1 mL 无菌水离心洗涤2 次后，依次用1 mL 50%，70%，80%，90%（体积分数）的乙醇溶液脱水处理30 min，最后用1 mL 无水乙醇脱水处理1 h。将已固定的被膜菌无水乙醇溶液少量多次的滴到细胞爬片上，室温晾干后，于37 ℃干燥12 h。用SEM 观察被膜菌的微观形貌和黏附团聚状况。

1.4.3 涂膜表面腐败希瓦氏菌生物被膜相关指标的测定

1）胞外多糖（EPS）的测定 取在菌悬液中培养一定时间的涂膜，用1 mL 的无菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，随后加入2 mL 无菌PBS 超声剥离生物被膜（224 W 53 kHz，10 min），取1 mL超声后的菌悬液在4°C，20 000×g 条件下离心20 min，用0.22 μm 膜过滤器过滤，根据EPS 酶联免疫分析试剂盒操作步骤测定上清液中胞外多糖含量。用酶标仪测定450 nm 波长下的吸光度，利用标准曲线计算样品中的EPS 浓度。

2）代谢活性的测定 取在菌悬液中培养一定时间的涂膜，用1 mL 无菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）洗3 次后，用100 μL LB 肉汤和50 μL XTT 试剂进行培养，用酶标仪测定28 ℃恒温培养箱中培养3 h 后的OD490nm值。

3）总蛋白的测定 参照张家涛[26]和王多宁等[27]的方法，绘制标准曲线。取在菌悬液中培养24 h 的涂膜，超声处理以剥离生物被膜。取1 mL超声后的菌悬液，加入200 μL RIPA 裂解液，混匀后于4 ℃下静置20 min，53 kHz 224 W 冰浴超声处理40 min。4 ℃，10 000×g 条件下离心15 min，于-20 ℃保存备用。将10 μL 上清液与200 μL 考马斯亮蓝染色液混匀，用酶标仪测定静置5 min后溶液的OD595nm值。生物被膜中的总蛋白浓度根据所绘标准曲线计算。

4）Na+/K+-ATP 酶活力和AKP 酶活力的测定

将超声剥离生物被膜的菌悬液转移至10 mL 无菌离心管中，在冰浴条件下用超声波细胞破碎仪进行超声处理，细胞破碎液于-20 ℃保存。参照试剂盒试验步骤分别测定Na+/K+-ATP 的酶活力和AKP 的酶活力。

1.5 数据分析

接触角分析测定样品的6 个不同位置，其余试验重复3 次。使用Origin 9.1 软件绘图，采用SPSS 20.0 软件中单因素方差分析的Duncan 多重比较法进行显著性分析。结果均以“平均值±标准偏差”表示，P〈0.05 时有显著差异。

2 结果与分析

2.1 改性SiOx/WPU 涂膜的表征分析

2.1.1 改性SiOx/WPU 涂膜的微观结构表征 未改性的SiOx 颗粒及改性SiOx/WPU 涂膜表面的微观形貌如图1 所示。由图1（a1）可见，气相纳米SiOx 颗粒呈球形，粒径约为10 nm；而改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 颗粒粒径增加至30～50 nm，出现明显的团聚现象（图1（a2-a3））。由图1（b1）可见，微米级SiOx 颗粒由微纳米两种级别的颗粒构成，以直径约1～3 μm 的颗粒为主；改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面微纳米粒子交互存在，形成了微纳米复合结构（图1（b2-b3））。图1（c1）表明，由于制备过程中高浓度的表面活性剂起到了模板导向剂的作用，使C-SiOx 颗粒发生交联，从而形成了六方相胶束[28]；而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面均匀分布粒径约为400 nm 的SiOx颗粒（图1（c2-c3））。

图1 未改性SiOx 颗粒（a1～c1）及其改性SiOx/WPU 涂膜（a2～c2，a3～c3）表面的SEM 图Fig.1 SEM images of unmodified SiOx particles（a1-c1）and their modified SiOx/WPU coatings（a2-c2，a3-c3）

2.1.2 改性SiOx 和SiOx/WPU 涂膜XRD 和FIIR 分析 改性SiOx 颗粒及对应的改性SiOx/WPU涂膜的XRD 谱图如图2A～2B 所示。改性SiOx 颗粒均在21.1°处出现SiOx 的非晶衍射峰[29]，表明SiOx 颗粒的微观形貌不会影响其结晶性能。由图2B 可见，改性SiOx/WPU 涂膜的非晶衍射峰移至20.8°处，然而并未出现WPU 的特征峰，这可能是由于WPU 为大分子有机物，分子链较长，其非晶态衍射峰与SiOx 颗粒的非晶衍射峰重合。

图2 改性SiOx 颗粒、改性SiOx/WPU 涂膜的XRD 谱图（A～B）及改性SiOx 颗粒的FI-IR 谱图（C）Fig.2 XRD spectra of modified SiOx particels（A）and modified SiOx/WPU coatings（B），and FI-IR spectra of modified SiOx particels（C）

图3C 为3 种改性SiOx 颗粒的FT-IR 谱图。3 700～3 300 cm-1处的吸收峰为-OH 的伸缩振动峰，1 635 cm-1附近的吸收峰为-OH 的弯曲振动峰，-CH2的反对称和对称伸缩振动峰出现在2 922 cm-1和2 852 cm-1处[30]；2 365 cm-1和2 345 cm-1处的峰为空气中CO2的吸收峰；1 085 cm-1处和808 cm-1处分别属于Si-O-Si 的不对称伸缩振动和对称伸缩振动，947 cm-1处的峰归因于Si-O 的伸缩振动，在467 cm-1处为O-Si-O 的弯曲振动峰[31]。由图2C（a）可见，改性气相纳米SiOx 颗粒在3 655 cm-1处出现气相纳米SiOx 颗粒中游离-OH 的特征峰，在1 635 cm-1附近出现-OH 和-NH2的弯曲振动峰；气相纳米SiOx 颗粒中-CH2的反对称和对称伸缩振动峰出现在2 922 cm-1和2 852 cm-1处。由图2C（b）可见，改性微米级SiOx 颗粒在3 700～3 300 cm-1处有较强的宽吸收峰，且吸收峰的中心位置向低波数移动，在1 635 cm-1处有强度较弱的窄吸收峰，说明样品中存在大量的缔合-OH，即改性微米级SiOx 颗粒中有结合水的存在。由图2C（c）可见，改性C-SiOx 颗粒在3 700～3 300 cm-1处出现的肩峰和宽峰分别为-OH 和CTAB 中-NH3的伸缩振动峰；2 929 cm-1和2 855 cm-1处出现的峰与CTAB 中-CH2的反对称和对称伸缩振动有关。此外，对于各改性SiOx 颗粒PFOTS 中的-CF2和-CF3伸缩振动峰出现在747 cm-1和707 cm-1处，表明3 种SiOx 颗粒均已被氟化剂成功改性。

图3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 测量光谱（A）及高分辨率XPS 谱图（B～F）Fig.3 XPS survey spectra（A）and high resolution XPS spectra（B-F）of modified SiOx/WPU coatings

2.1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 分析 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 谱图如图3A 所示，由图可见，各涂膜表面均含有F、O、C、Si 4 种元素，且由O 和Si 的相对含量可知，各涂膜表面单位面积上改性SiOx 颗粒的含量相近。而改性C-SiOx/WPU涂膜表面F 的相对含量最高，达到28.2%，改性气相纳米涂膜次之，为26.4%，改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面F 的相对含量最低，为24.9%。

图3B～3E 为改性SiOx/WPU 涂膜的高分辨率XSP 谱图。由图3B 和3C 可见，各改性SiOx/WPU涂膜的F1s 峰分别出现在688.5，688.9，688.6 eV处，无显著性差异。O1s 峰在532.5，532.8，532.6 eV处，属于O-C（533.2 eV）、O-Si（532.4 eV）和O=C（531.7 eV）。由图3D 可见，3 种涂分别在102.9，103.1，102.9 eV 处出现的Si2p 峰，可能属于Si-C（102.0 eV）、Si-O-Si（103.4 eV）和Si-OH（104.5 eV）[32]。由图3E 可见，3 种改性SiOx/WPU 涂膜的C1s 峰出现分峰现象。图3F 为对改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面C1s 峰进行分峰处理的XPS图谱，294.1，291.8，285.3，284.3 eV 处的峰分别归因于-CF3、-CF2、C-O 和C-C/C-H。涂膜表面的F1s、Si2p 和C1s 的检测 结果表 明，涂膜已 被PFOTS 成功改性[33]。

2.1.4 改性SiOx/WPU 涂膜AFM 表征 图4 为SiOx/WPU 涂膜的AFM 图像。由图4a 可知，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面的微米级凸起完全由几十纳米的SiOx 颗粒聚集而成，其平均粗糙度Ra 值为273.1 nm，表面高度差约为2 μm。由图4b可知，改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面高度差约为1.6 μm，Ra 值为212.3 nm，其表面凸起主要是由纳米级的SiOx 颗粒相互聚集和微纳米级的SiOx 颗粒相互堆叠而成。由图4c 可知，改性CSiOx/WPU 涂膜与改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜相似，表面的凸起仅由粒径约为400 nm 左右的SiOx 颗粒组成。此结果与SEM 检测结果一致。

图4 改性SiOx/WPU 涂膜高分辨率AFM 图Fig.4 AFM images of modified SiOx/WPU coatings

2.1.5 改性SiOx/WPU 涂膜的热稳定性评价 图5a 为各改性SiOx/WPU 涂膜在20～250 ℃的DSC曲线图。改性SiOx/WPU 涂膜的玻璃化转变温度（Tg）和熔化温度（Tm）主要与WPU 中的软段链和硬段链有关。WPU 中软段链与硬段链的玻璃化转变温度相差很大，其中软段链的玻璃化转变温度（Tgs）远低于0 ℃，而硬段链的玻璃化转变温度（Tgh）则在80～100 ℃，远高于室温[34]。由图可见，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜在81.96 ℃处出现第1个吸热峰，而改性微米级SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜分别在64.02 ℃和25.94 ℃处出现第1 个吸热峰，在79.03 ℃和79.86 ℃处出现第2 个吸热峰，表明3 种改性SiOx 颗粒均可与涂膜中WPU 的软段链发生相互作用。而3 种改性SiOx/WPU 涂膜分别在146.08，140.36，153.27 ℃出现的吸热峰对应于涂膜中WPU 硬段链的熔化温度（Tmh），与其硬段链的短程有序转变有关[33]。3种涂膜中WPU 的硬段链短程有序化的焓变（ΔH）分别为14.49，15.82，19.48 J/g，表明C-SiOx 颗粒与WPU 的硬段链相互作用弱于改性气相纳米SiOx 颗粒和改性微米级SiOx 颗粒。此外，CTAB的熔化吸热使改性C-SiOx/WPU 涂膜在210.75 ℃出现一个弱吸热峰。

图5 不同粒径低表面能改性SiOx/WPU 涂膜的DSC 图（a）、TGA 图（b）和DTG 图（c）Fig.5 DSC（a），TGA（b）and DTG（c）spectra of low surface energy modified SiOx/WPU coatings with different particle sizes

图5b 和5c 为改性SiOx/WPU 涂膜的TGA 和DTG 曲线。由图可见，改性SiOx/WPU 涂膜的初始质量损失均发生在44～100 ℃左右，这是由涂膜中的水分损失造成的。第2 阶段的质量损失发生在150～200 ℃之间，主要与涂膜中WPU 硬段链中脲基甲酸酯的分解有关。在200～320 ℃改性气相SiOx/WPU 涂膜、改性微米级SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜的质量损失主要与涂膜中WPU 硬段链的脲基甲酸酯和氨基甲酸酯分解有关，其质量损失依次约为11.49%，12.38%，17.35%。由此可见，改性气相SiOx 颗粒和改性微米级SiOx颗粒对WPU 中硬段的相互作用更强，这与DSC分析结果一致。在320～430 ℃之间，3 种改性SiOx/WPU 涂膜的质量损失分别约为12.33%，13.81%，14.40%，此阶段的质量损失主要与涂膜中WPU 软段链中聚醚多元醇的分解有关。在430～640 ℃之间，3 种改性SiOx/WPU 涂膜的质量损失主要与改性剂和WPU 中残留物的碳化有关，分别约为13.04%，14.74%，11.93%。

2.1.6 改性SiOx/WPU 涂膜表面的接触角和表面能 由图6 可见，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜的水接触角为155.9°±5.9°，正十六烷的接触角为0°，表面能为（23.4±2.4）J/m2，为超疏水超亲油表面。这是因为改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面完全由几十纳米的SiOx 颗粒构成，其表面的的微米级凸起形成的气层无法抵御正十六烷的完全浸润。改性微米级SiOx/WPU 涂膜的水接触角为154.5°±2.1°，正十六烷的接触角为132.8°±0.7°，表面能最低，仅有（0.3±0.1）J/m2，为超双疏表面。结合SEM 结果分析认为，这是因为改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 微纳米粒子交互存在，形成了微纳米复合结构，这种不规则的拓扑结构使涂膜与液滴间可以形成固-气-液三相交互的复合界面，液滴无法浸润涂膜表面，使其具有超双疏性能。改性C-SiOx/WPU 涂膜的水和正十六烷接触角分别为139.9°±3.5°和0°，表面能最高，达到（229.6±4.2）J/m2，为疏水超亲油表面。这是因为改性C-SiOx/WPU 涂膜表面与改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面相似，仅由粒径均一的SiOx 颗粒构成，无法形成微纳米复合结构，因此同样会被正十六烷完全浸润。结合涂膜的XPS 谱图分析可得，表面F 相对含量最低的改性微米级SiOx/WPU涂膜的表面疏水疏油效果最好，表明高氟含量并不是形成涂膜超双疏性能唯一特性，表面微观形貌同样显著影响涂膜的疏水疏油性能和表面能。

图6 改性SiOx/WPU 涂膜的表面湿润性和表面能Fig.6 Surface wettability and surfaceenergy of the modified SiOx/WPU coatings

2.2 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌微观形貌分析

图7 为培养不同时间后各涂膜表面腐败希瓦氏菌生物被膜微观形貌的SEM 图。由图7（a1～c1）可见，培养4 h 后，各涂膜表面黏附的被膜菌数量均较少。由图7（a2～c2）可见，培养12 h 后，多个细菌的不可逆黏附出现在超疏水超亲油性的改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜和疏水超亲油性的改性CSiOx/WPU 涂膜表面，且改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的细菌开始形成微菌落，而改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面仍为单个细菌的不可逆黏附。如图7（a3-c3）所示，培养24 h 后，改性气相SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌主要以微菌落的形式存在；改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的细菌数量大量增加，微菌落相互聚集，形成成熟的生物被膜；而改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面的被膜菌则刚开始形成微菌落。

可见，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的被膜菌数量最多，在24 h 时涂膜表面的生物被膜已到成熟期，这是由于改性C-SiOx/WPU 涂膜仅具有疏水性能，不能有效抑制被膜菌的黏附及其生物被膜的形成。改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的细菌数量次之，在24 h 时未形成成熟的生物被膜，这可能是由于改性气相纳米SiOx/WPU涂膜表面的疏水性能更强，使其与菌悬液之间形成了一个较小空气层，可以在一定程度上阻碍被膜菌与涂膜表面的接触，从而延缓了涂膜表面生物被膜的形成。由微纳米级SiOx 颗粒形成不规则的拓扑结构，构成改性微米级SiOx/WPU 涂膜具有超双疏性能，该薄膜在菌悬液中可较长时间地维持Cassie 状态，且空气层占比最多，因此表面黏附的细菌数量最少，抑制生物被膜形成的能力最优，在24 h 时才开始出现微菌落。

2.3 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌相关指标分析

图8 为改性SiOx/WPU 涂膜表面腐败希瓦氏菌生物被膜相关指标的测定结果。由图8a 和8b可见，0～2 h，涂膜表面细菌数量开始增加，培养基中游离的腐败希瓦氏菌开始黏附在涂膜表面进行可逆黏附。相较而言，虽然3 种涂膜表面黏附的细菌数量无显著差异，但是改性微米级SiOx/WPU涂膜表面黏附的细菌数量少于改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜，表明超双疏性的改性微米级SiOx/WPU 涂膜可抑制细菌的初期黏附。在此阶段，各样品表面被膜菌代谢活性均缓慢增加无显著差异。2～12 h，涂膜表面的被膜菌数量增加趋势减缓，细菌开始进行不可逆黏附。在此阶段，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌数量和代谢活性最高，说明疏水超亲油性的改性C-SiOx/WPU 涂膜有利于细菌的不可逆黏附；改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的细菌数量及其代谢活性次之，表明超疏水超亲油性的改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜对细菌的不可逆黏附有一定程度的抑制作用；而超双疏性的改性SiOx/WPU涂膜对细菌不可逆黏附的抑制效果最好，因此其表面的被膜菌数量和代谢活性处于最低水平，表明。12～24 h，被膜菌形成微菌落，从而促进生物被膜的形成。在此阶段，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌数量仍以较快的速度增加，并在24 h 时与改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌数量相近，而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面细菌增长逐渐变缓，表明改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜在一定程度上可以抑制细菌的黏附及生物被膜的形成，然而其表面利于被膜菌的定植，因此其表面被膜菌代谢活性继续增加。而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜已接近成熟期，且由于此阶段涂膜表面被膜菌数量过多，胞外多聚物逐渐转变为被膜菌的营养提供体，使菌体自身的代谢活性降低。此时，改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面的黏附被膜菌数量仍保持最低水平，表明该涂膜可有效抑制被膜菌形成微菌落，进而形成生物被膜。可见，超双疏的改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面可显著抑制被膜菌的黏附及其表面生物被膜的形成。

图8 改性SiOx/WPU 涂膜表面腐败希瓦氏菌生物被膜相关指标的变化Fig.8 Changes of related indexes of Shwanella putrefaciens biofilm on the modified SiOx/WPU coatings

抑制细菌EPS 的分泌可以控制细菌与材料表面的初始黏附以及形成生物被膜的膜性结构[35]。由图8c 可见，各涂膜表面EPS 均随着培养时间的延长而逐渐增加。在0～12 h 细菌的可逆与不可逆黏附阶段，改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面EPS增加最慢，表明超双疏的改性微米级SiOx/WPU涂膜可抑制细菌EPS 的分泌及微菌落的形成。此时，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面EPS 的增加速度最快，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜次之。在12～24 h，改性C-SiOx/WPU 涂膜的表面EPS 的增加变得缓慢，而改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面EPS 继续增加，在24 h 时涂膜表面被膜菌EPS 含量超过了改性C-SiOx/WPU 涂膜，而改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌的EPS 含量虽然继续增加，但仍保持较低水平。该结果表明，具有单一粗糙结构的改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜已成熟，EPS 分泌逐渐减少；改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜在此阶段更有利于细菌分泌EPS形成微菌落；而由于改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面的特殊微纳米拓扑结构，其仍可抑制细菌形成微菌落，故EPS 分泌最少。

如图8d 所示，在生物被膜形成过程中各涂膜的表面生物被膜总蛋白逐渐增加。其中，改性CSiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜总蛋白含量增加速度最快，高于同期其它样品，可能是因为该涂膜表面由粒径为400 nm 的SiOx 颗粒组成，无微米级凸起，尽管表面含有最多的氟碳化合物，但仅具有疏水性能，无疏油性能，无法阻止被膜菌的黏附，并抑制其生物被膜的形成。培养至12 h 之前，改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜的总蛋白含量较低，培养至24 h 时，涂膜表面总蛋白量与改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的总蛋白含量相当，这是由于其虽具有超疏水性能，但其疏油能力仍较差，培养至12 h 后，细菌在涂膜表面大量黏附，该结果与被膜菌的生长曲线试验结果一致。在生物被膜培养过程中，改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜总蛋白的含量最低，这是由于其与菌悬液间维持较长时间的Cassie 状态，“捕获”足够的空气，从而抑制细菌的不可逆黏附和已黏附细菌分泌EPS，并阻止其形成微菌落。

ATP 酶存在于细胞内外膜上，主要参与ATP的分解，胞外ATP 酶的活性揭示了被膜菌细胞膜的完整性[36-38]。AKP 酶主要存在于细胞膜与细胞壁之间，胞外AKP 酶的水平同样也可以反应被膜菌细胞壁受损伤的程度[39]。如图8e～8f 所示，在培养24 h 后，超双疏性的改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌ATP 酶和AKP 酶活性最低，表明生物被膜内ATP 酶和AKP 酶活性最低，这是由于其表面特殊的微纳米拓扑结构使涂膜可有效抑制细菌的黏附，阻止细菌胞外多糖的分泌，进而抑制被膜菌形成微菌落。

3 结论

采用不同SiOx 颗粒改性获得的改性SiOx/WPU 涂膜的理化性能差异显著，对水产品腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制性能不同。其中由两种不同粒径的SiOx 颗粒形成微纳米拓扑结构的改性微米级SiOx/WPU 涂膜表面表现为超双疏性，表面能最低，涂膜热稳定性较高。可显著抑制细菌的黏附和已黏附细菌的代谢活性、EPS 分泌、ATP 酶和AKP 酶活性，进而抑制微菌落的形成。改性气相纳米SiOx/WPU 涂膜表现为超疏水超亲油性，表面能较低，涂膜的热稳定性最高，可以抑制细菌的初期黏附，然而随着培养时间的延长，表面黏附细菌量快速增加。改性C-SiOx/WPU 涂膜表现为疏水超亲油性，表面能最高，热稳定性最差，抗细菌黏附的性能最差。采用微米级SiOx 颗粒改性制备的改性SiOx/WPU 涂膜对水产品腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制性能最优，本研究可为制备具有抗生物被膜性能的食品包装材料提供技术支撑。