糖含量对大豆蛋白起泡性的影响

薛远，宋春丽*，任 健

（1 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院 黑龙江齐齐哈尔161006 2植物性食品加工技术教育部工程研究中心 黑龙江齐齐哈尔 161006）

大豆蛋白营养价值高，必需氨基酸种类齐全，接近动物蛋白，是一种优质植物蛋白[1]。此外，该蛋白作为重要的蛋白质配料而广泛应用于食品加工领域[2]。蛋白质的起泡性是赋予食品良好的质构、稳定性和加工特性的重要内在因素。例如，利用蛋白质包裹的方式保留住空气，赋予面包、蛋糕、饼干、蛋白霜、冰淇淋和一些烘焙产品理想的结构属性[3-4]。然而，天然食品蛋白质的溶解性、起泡性等性质常常不能满足产品的需求[5-6]。因此，有必要对食品蛋白质进行改性处理，以获得理想的功能性质。

美拉德反应在一定温度和湿度条件下，能够改变蛋白质分子结构，将糖分子的亲水性羰基引入蛋白质分子之中，该反应无需加入化学试剂，安全性高。国内外许多学者利用美拉德反应显著提高了大豆蛋白的起泡性，探索不同种类糖基的导入对蛋白质功能性质的影响规律[7-9]。值得注意的是，在利用美拉德糖基化反应实现蛋白质糖基化的同时，会伴随着蛋白质自交联反应[10]。在剖析蛋白质糖基化对功能性质的影响规律时，无法充分界定导入糖分子含量变化本身所带来的影响。

本研究采用美拉德反应获得大豆蛋白糖基化产物，利用β-淀粉酶依次断裂导入糖基的麦芽糖单位，改变糖基化产物侧链糖基含量，从而获得具有不同糖含量的大豆蛋白。构建出自交联程度相同，而侧链糖基不同的糖基化产物模型，通过对各指标的分析和评估，确定、剖析糖基化产物的起泡性变化，从而为定向开发具有特定功能的蛋白质提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂豆粕，哈尔滨市宾县禹王植物蛋白有限公司；麦芽糊精（Maltodextrin，MD，DE 值：8～10），山东禹城保龄宝生物有限公司；β-淀粉酶（30 U/mg），上海麦克林生物有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）预制胶片，金斯瑞生物科技公司；低分子质量标准蛋白质，北京欣经科生物技术有限公司；考马斯亮蓝R-250，美国Sigma 公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

XW-80A 型涡旋混合器，上海青浦沪西仪器厂；T25 型均质机，德国IKA 公司；RF-530IPC 型荧光分光光度计，日本岛津公司；Nano-ZS90 型纳米粒度、Zeta 电位分析仪，英国Malvern 公司；DYY-10 型三恒电泳仪，北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的提取 将脱脂豆粕与蒸馏水按1∶10（m/V）的比例低温溶胀过夜，使其充分水合，然后用2 mol/L 的NaOH 调节pH 值 至8.5，50 ℃水浴搅拌2 h，转速为30～35 r/min。随后将混合物在3 000 r/min 离心20 min，收集上清液。用2 mol/L 的HCl 将pH 值调至4.5，将其4 ℃放置分层后3 000 r/min 离心20 min，收集沉淀，用蒸馏水（pH 4.5）水洗2 次后，用2 mol/L 的NaOH 调节pH 值至8.0。随后冷冻干燥48 h，制得SPI，蛋白质含量为91.36%。

1.3.2 糖基化产物的制备 制备SPI 分散液（70 mg/mL，pH 8.0），将SPI 溶液与麦芽糊精溶液（pH 8.0）按一定比例充分混合，进行美拉德反应（4%SPI，40 min，质量比1∶2），得到反应产物。将反应产物的pH 值调至4.5，3 000 r/min 离心10 min，收集沉淀，加蒸馏水溶解并调节pH 值至7.0。在4℃下透析（8～14 ku）24 h，除去游离的麦芽糊精分子，将透析产物（M0）冷冻干燥，备用。

1.3.3 不同糖含量糖基化修饰产物的制备 制备蛋白质分散液（M0，40 mg/mL，pH 7.0）于50 ℃时添加150 U/g（以蛋白质质量为基准）β-淀粉酶，恒温振荡不同时间（5，40，80 min）。反应结束后，立刻取出，于95 ℃灭酶5 min，冷冻干燥，得到修饰产物M1（反应5 min）、M2（反应40 min）和M3（反应80 min）。将其在4 ℃其下透析（8～14 ku）24 h，除去游离的麦芽糊精，将糖基化修饰产物冷冻干燥，备用。

1.3.4 糖基化修饰产物中糖含量的测定 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，最后与苯酚生成橙黄色化合物，以比色法测定。

葡萄糖标准曲线的绘制：配制0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 葡萄糖标准溶液于具塞试管中，用蒸馏水补至1.0 mL，再分别加入1.0 mL 的5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL 浓硫酸，摇匀后静止10 min。随后30℃水浴处理20 min。反应液在490 nm 波长处测定吸光度。标准曲线的横坐标为葡萄糖质量浓度，纵坐标为吸光度。

样品的测定：将样品（40 mg/mL）稀释100 倍，取1 mL 样品溶液同法测定样品的吸光度，SPI 作为空白对照组（4.06 g/100 g 大豆蛋白）。

1.3.5 SDS-PAGE 电泳 参照Song 等[11]的方法稍作修改，配制3 mg/mL 蛋白溶液，取100 μL 样品溶液和等量的样品缓冲液进行混合，离心后取上清液煮沸5 min，冷却待用。分离胶含量120 mg/mL，浓缩胶含量50 mg/mL。上样量12 μL，电压调为120 V，随着溴酚蓝进入，待溴酚蓝距下缘0.5～

1.0 cm 时，结束电泳。

蛋白染色：电泳结束后，取出胶片放入考马斯亮蓝染色液中染色30 min，随后用脱色液进行脱色，至背景色完全褪去为止。

糖蛋白染色：电泳结束后，用12.5%三氯乙酸溶液固定胶片15 min 后用双蒸水振荡水洗3 次（每次5 min），再用1%的高碘酸浸泡胶片15 min，将浸泡后的胶片用双蒸水振荡水洗4 次（每次10 min）；将水洗后的胶片放入Schiff 试剂避光染色30 min 后，再用0.5%偏重亚硫酸钠振荡水洗，直至被染色的粉色糖蛋白条带出现。

1.3.6 内源荧光光谱分析 参照Liu 等[12]的方法，进行内源荧光光谱的测定。将蛋白质样品溶于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）配制成1 mg/mL 的蛋白样品溶液，随后在10 000 r/min 的条件下离心15 min 后，取上清液4 mL，在发射波长为290 nm，激发和发射狭缝光度为5 nm 条件下，扫描300～400 nm 范围的发射光谱。以波长为横坐标，相对荧光强度为纵坐标作图。

1.3.7 起泡性及泡沫稳定性 将蛋白质样品溶于磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，配制质量浓度为10 g/L的蛋白质溶液。取100 mL 该溶液，以12 000 r/min的转速搅打1 min，记录数据，平行测定3 次[13]。蛋白质的起泡性（FC）和泡沫稳定性（FS）的计算方法见式（1）和式（2）。

式中，VL——搅打前液体的体积（mL）；V0——搅打刚停止时泡沫的体积（mL）；V30——搅打后静置30 min 时泡沫的体积（mL）。

1.3.8 溶解性 参照Peng 等[14]的方法测定蛋白质的溶解性。将蛋白质样品溶于pH 值为7.0 的缓冲液，配制成2 g/L 蛋白质溶液。涡旋后4 ℃存放，使其充分水合。次日8 000 r/min 离心20 min，收集上清液，采用福林酚法测定其可溶性蛋白的含量。以待测样品中可溶性蛋白质含量的占比表示蛋白质溶解性。

1.3.9 水合粒径分布和Zeta 电位 参照Hayakawa等[15]的方法，配制一定浓度的蛋白质分散液并将浓度稀释至0.1 mg/mL，用0.45 μm 水膜过滤，随后用粒度分析仪测定样品的水合粒径分布和Zeta电位，平行测定3 次。

1.3.10 表观黏度的测定 参照Gu 等[16]的方法用马尔文流变仪测定蛋白质的表观黏度。配制质量浓度为40 mg/mL 蛋白样品溶液（pH 7.0）。测定时，将样品分散液缓慢注入、充满夹具（直径为60 mm，锥角为0.5°的锥板）。在温度25 ℃，频率0.1～100 s-1时，测试样品的表观黏度。

2 结果与分析

2.1 糖基化修饰产物的糖含量

控制β-淀粉酶对SPI 美拉德产物（M0）的水解时间（分别为5，40，80 min）得到糖含量不同的修饰产物，其糖含量分别为8.10，4.88，2.21 g/100 g大豆蛋白。与M0（12.44 g/100 g 大豆蛋白）相比，修饰产物糖含量均存在显著性差异（P〈0.05）。

表1 4 种糖基化修饰产物的糖含量分析结果Table 1 Glycan contents of the modified soy protein isolates

2.2 SDS-PAGE 电泳

由图1a 可以看出，与SPI（泳道1）相比，糖基化修饰产物（泳道2～5）的7S 亚基α 和β 谱带以及11S 亚基的B 谱带显色反应减弱，高分子区域显色反应明显增强，且出现了新的谱带。表明大豆蛋白的7S 亚基和11S 亚基成分与麦芽糊精发生共价结合，形成了高分子共聚物，并且被截留在分离胶顶部[17]。

图1 大豆蛋白及其糖基化修饰产物的SDS-PAGE 电泳图Fig.1 SDS-PAGE of soy protein isolates and its glycated products

由图1b 可以看出，糖基化修饰产物（泳道2～5）在分离胶顶端有一条明显的条带，而且与阳性对照辣根过氧化物酶（糖蛋白，泳道L）相似，具有明显的糖染色现象。SDS-PAGE 分析结果显示大豆蛋白修饰产物是一个交联的大豆蛋白，而且含有糖基。结果表明，大豆蛋白与麦芽糊精发生了美拉德反应，生成了蛋白质共聚物，且该物质为糖蛋白。这直接证实了通过美拉德反应，可以将麦芽糊精导入到大豆蛋白分子中[18]。

2.3 内源荧光光谱分析

内源荧光光谱是对蛋白质分子的内源性荧光发色团（色氨酸、酪氨酸残基等）的研究[19]。SPI 及糖基化修饰产物的荧光光谱如图2 所示。

图2 大豆蛋白及其糖基化修饰产物的内源荧光光谱图Fig.2 Internal fluorescence spectrum of soy protein isolates and its glycated products

从图2 可以看出，SPI 的最大激发波长（λmax）是337 nm，是典型的色氨酸荧光光谱[20]。与SPI 相比，糖基化修饰产物的最大激发波长分别增加到346 nm（M0），343 nm（M1），343 nm（M2），342 nm（M3），表示荧光吸收呈现红移现象，表明糖基化修饰产物具有更疏松的蛋白质三级结构。这是因为蛋白质的色氨酸残基随反应的进行暴露在极性环境中，同时蛋白质分子与糖分子的共价结合也使环境极性增强[21]。同时由于β-淀粉酶作用位点的不同，产生不同空间位阻作用，也对大豆蛋白微环境造成不同影响[22]。

2.4 起泡性及泡沫稳定性

SPI 及糖基化修饰产物的起泡性及泡沫稳定性如图3 所示。SPI 的起泡能力为84.48%，M0 的起泡能力最高，为136.62%。由于糖基的导入显著提高了大豆蛋白的溶解性，糖基化修饰产物亲水性增强，当受到急速搅打时，混入大量气体，从而形成气液薄膜[23]，表现为起泡性增强[24]。修饰产物随着糖含量变化起泡能力分别达到98.66%（M1），96.08%（M2），91.36%（M3），且差异显著。结果表明，修饰产物的糖含量对大豆蛋白的起泡性影响显著。

图3 大豆蛋白及其糖基化修饰产物的起泡性及泡沫稳定性Fig.3 Relative overrun and foam stability of soy protein isolates and its glycated products

图4 大豆蛋白及其糖基化修饰产物的表观黏度Fig.4 Apparent viscosity of soy protein isolates and its glycated products

与SPI（57.05%）相比，M0 泡沫稳定性最高，为71.56%，修饰产物的泡沫稳定性均显著增强。这可能是蛋白质肽链受热展开，疏水基团暴露出来，增强了蛋白质分子在气液界面的张力，形成厚度高于SPI 的气液薄膜，从而增加泡沫稳定性[25]。此外，糖含量为4.88～8.10 g/100 g 大豆蛋白时，对泡沫稳定性影响不显著。

2.5 水合粒径分布、Zeta 电位及溶解性分析

水合粒径反映了糖基化修饰产物的聚集行为。如表2 所示，糖基化修饰产物的水合粒径由SPI 的134.4 nm 分别增大到169.4，165.4，162.6，151.2 nm。由于SPI 的游离氨基与麦芽糊精的羰基发生了结合，糖基化修饰产物的糖含量升高，水合能力增强，表现为平均粒径增大。

表2 大豆蛋白及其糖基化修饰产物的水合粒径分布、电位及溶解性Table 2 Hydrodynamic size distribution，zeta-potential and solubility of soy protein isolates and its glycated products

溶液稳定性与溶液形成的界面面积有关，进而表现出不同的泡沫稳定性。Zeta 电位是在蛋白质溶液中带电粒子剪切面的电势，通常电势被用来度量粒子之间的相互吸引力和相互排斥力；也是对体系分散稳定性度量的重要参数之一。糖基化修饰产物的电位绝对值增大（从18.3 增大到30.9）。这是因为SPI 经过糖基化改性后，空间结构发生变化，带电基团暴露出来，导致Zeta 电位绝对值进一步增大。此外，随着糖含量的减少，电位的绝对值逐渐减小（30.3，29.4，28.7）。电位的绝对值越大，粒子之间的排斥作用越显著[26]，糖含量减少，粒子之间排斥力减小，导致溶液的稳定性降低。

在pH 值为7.0 时，糖基化修饰产物的溶解性显著升高。美拉德反应引起的SPI 分子结构变化会产生特定的表面特性和功能特性。通过美拉德反应，糖分子上的亲水性羟基与蛋白质的游离氨基相结合，将大量的亲水基团导入蛋白质分子之中，蛋白质分子的空间稳定[27]。蛋白质分子结构伸展且空间稳定，溶液受到搅拌时，迅速与水分子反应且产生大而稳定的界面面积，进而表现为起泡能力以及泡沫稳定性增强。

2.6 表观黏度

当蛋白质溶液受到急速较搅打时，会形成气液薄膜产生泡沫，气液薄膜的黏性与蛋白质溶液的泡沫稳定性有关。表观黏度可以评价流体黏稠度，用于表征液体中分子间吸引力[28]。SPI 及其糖基化修饰产物的表观黏度测定结果如图6 所示。与SPI 相比，糖基修饰化产物分散液的表观黏度均显著增加，且表现出非牛顿流体的特征（随剪切速率的增加，表观黏度逐渐降低）。可能是蛋白质游离氨基与糖的亲水性羰基结合生成大分子物质，糖基化修饰产物的相对分子质量、水合粒径和亲水性增加，因此M0 表观黏度增加[29]。随着糖基化修饰产物侧链糖基含量变少，水合作用变小，糖基化修饰产物的表观黏度逐渐减小，然而仍高于SPI。当体系的黏度增大，溶液被急速搅打时，蛋白质分子迅速吸附在气液薄膜上，表面张力降低，形成一个有较强凝聚力和黏性的气液薄膜，泡沫稳定性显著增强。

3 结论

美拉德反应协同β-淀粉酶定向断裂共聚糖链，能够构建出自交联程度相同，而侧链糖含量不同的糖基化大豆蛋白。该反应显著提高了SPI 的起泡性及泡沫稳定性；起泡性从83.48%提高到132.63%；泡沫稳定性从57.95%提高到71.56%。糖含量对SPI 的起泡性有显著影响，而且随糖含量的增加，起泡性逐渐增大；然而糖含量变化（4.88～8.10 g/100 g 大豆蛋白）对SPI 的的泡沫稳定性影响不显著。相应的，随着糖含量减少，糖基化产物的水合粒径、Zeta 电位绝对值、溶解性逐渐减小，表观黏度逐渐降低。研究结果为定向开发特定功能的大豆蛋白功能性配料提供理论支撑。