藤黄健骨胶囊通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路调节绝经后骨质疏松大鼠破骨细胞分化*

安方玉， 颜春鲁， 孙柏， 汪春梅， 柳颖， 王霞霞， 马海珍， 张蕊， 陈振东

（甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis， PMOP）是一种骨折发生率极高的常见骨病［1-2］。围绝经期的女性由于卵巢功能下降使雌激素分泌急剧下降，而雌激素分泌急剧下降导致骨吸收加速和骨形成减少可能是诱发PMOP发生的关键病机［3-4］。

研究表明，沉默信息调节因子1（silent information regulator 1， SIRT1）能够参与机体的骨代谢、自噬、细胞凋亡和衰老等生物学过程［5-6］。另有研究表明SIRT1具有类雌激素的作用，在多种骨系细胞（破骨细胞、成骨细胞和骨细胞等）中均有表达［7］，抑制SIRT1表达可以促进核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）诱导的骨髓巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMM）向破骨细胞分化［8］，而破骨细胞祖细胞中的SIRT1还能够通过抑制核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）活性来抑制其自身分化［9］。其他研究进一步发现，SIRT1对破骨细胞生成的抑制是通过NF-κB通路和氧化应激相互作用而介导的，这些途径最终激活活化T细胞核因子胞浆1型（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）以诱导破骨细胞生成和破骨细胞融合。还有研究证明，NF-κB抑制剂显著降低核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3， NLRP3）炎症小体表达水平，缓解骨吸收［10］。上述研究提示SIRT1/NF-κB/NLRP3介导的破骨细胞分化可能是治疗PMOP潜在靶点。

藤黄健骨胶囊［Tenghuang-Jiangu capsule， TJC；熟地黄、鹿衔草、骨碎补（烫）、肉苁蓉、淫羊藿、鸡血藤和莱菔子］具有补肾活血之功效。临床研究发现，TJC通过提高PMOP患者的骨密度和抑制骨转换来改善患者的中医临床症状积分，达到治疗PMOP的目的，且临床疗效明显［11-12］。也有研究报道，TJC可提高血钙水平，还可降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，从而提高骨密度，也可能通过降低破骨细胞的活性、功能抑制骨吸收、促进成骨细胞形成来治疗骨质疏松症、膝骨关节炎及腰椎间盘突出等疾病［13-15］。上述文献结果证明TJC对PMOP有明确疗效。基于此，我们提出如下假设：TJC可能通过抑制SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路来抑制PMOP的炎症反应，进而来抑制破骨细胞分化，从而发挥对PMOP的潜在疗效。因此，本研究通过建立PMOP大鼠模型，旨在探讨TJC对PMOP大鼠SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路关键蛋白表达的影响及可能的分子机制。

材料和方法

1 动物

70只SPF级SD雌性大鼠，体质量（180±20） g，购自甘肃中医药大学科研实验动物中心，许可证号为SCXK（甘）2020-0001。饲养于甘肃中医药大学动物实验中心SPF级实验室，实验过程中所有动物均自由饮水、摄食。

2 主要试剂

戊酸雌二醇（estradiol valerate， ESV）片购自拜耳医药保健有限公司；TJC购自甘肃省西峰制药有限公司；SIRT1抑制剂EX-527购自MedChemExpress；SIRT1兔单克隆抗体购自Abcam；NF-κB p65兔单克隆抗体购自GeneTex；NLRP3兔单克隆抗体和GAPDH兔单克隆抗体购自Immunoway；NFATc1兔单克隆抗体购自Abclonal；ECL化学发光显色试剂盒购自YEASEN；白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA试剂盒、IL-18 ELISA试剂盒和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA试剂盒购自FEIYA。

3 主要方法

3.1 实验动物分组及给药 选取60只SPF级SD雌性大鼠，适应性饲养1周，随机分为假手术组（sham组）、模型组［卵巢切除术（ovariectomy， OVX）组］、SIRT1抑制剂组（EX-527+OVX组）、阳性药物对照组（ESV+OVX组）、高剂量（0.36 g/kg）TJC（high-dose TJC， TJC-H）组、中剂量（0.18 g/kg）TJC（mediumdose TJC， TJC-M）组和低剂量（0.09 g/kg）TJC（lowdose TJC， TJC-L）组，每组10只。大鼠麻醉后，采取俯卧位，备皮后消毒手术区皮肤；沿背部后正中线作纵形切口长约1.0~1.5 cm，在乳白色的脂肪团中找到卵巢，结扎子宫角后摘除卵巢，然后伤口逐层缝合，同样方式切除对侧卵巢，而sham组大鼠只切卵巢附近白色脂肪组织，注意术后保温［16］。造模8周后，ESV+OVX组给予ESV片（0.09 mg/kg）灌胃治疗，TJC-H+OVX组、TJC-M+OVX组和TJC-L+OVX组给予TJC（0.36、0.18和0.09 g/kg）灌胃治疗，sham组和OVX组给予等体积蒸馏水，EX-527+OVX组给予等体积蒸馏水并腹腔注射1 mg/kg EX-527［17］，每日1次，连续8周［18］。给药结束后进行股动脉取血，离心血清，处死大鼠，进行标本采集，部分股骨组织用4%多聚甲醛固定液固定，部分股骨组织于-80 ℃冰箱冻存、备用。

3.2 实验大鼠一般状态及体重的观察 观察并记录各组大鼠的饮水进食、活动情况、精神状态、毛色变化等一般情况，定期称重并记录大鼠体重。

3.3 ELISA法检测血清中炎症因子的含量 将采集的股动脉血静置2 h后再置于冰箱4 ℃过夜，1 500~2 000 r/min离心5 min，取上清测定血清IL-1β、IL-18和TNF-α水平变化。根据IL-1β、IL-18和TNF-α大鼠ELISA检测试剂盒说明书，首先分别设置空白孔（不加样品和酶标记试剂）、标准孔（标准品50 μL）和样品孔（样品10 μL+样品稀释剂40 μL），37 ℃恒温箱中恒温孵育30 min并洗涤，然后每孔加入50 μL酶标试剂，37 ℃恒温箱中再次恒温孵育30 min并洗涤并洗涤，每孔均加入显色剂A（50 μL）和显色剂B（50 μL），37 ℃恒温箱内避光孵育10 min后加入终止液（50 μL），450 nm波长处检测各孔的吸光度（A值）。依据标准品绘制出标准曲线，再根据标准曲线和A值算出IL-1β、IL-18和TNF-α的含量。

3.4 双重免疫荧光观察破骨细胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白表达 TRAP为破骨细胞特异性标志物，故采用双重免疫荧光双染的方法分别检测各组大鼠股骨组织中TRAP蛋白分别与SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白共表达的情况，来反映破骨细胞中SIRT1、NF-κB、NLRP3蛋白的表达，具体操作方法如下：3%的H2O2避光10 min，PBS-Triton洗3次，每次3 min；100 mmol甘氨酸中和15 min，PBS-Triton洗3次，每次3 min；滴加封闭液，室温封闭1 h；弃去封闭液后，在切片组织上同时滴加TRAP抗体（1∶100）和SIRT1（1∶100）/NF-κB p65（1∶500）/NLRP3（1∶200）抗体后4 ℃孵育过夜；用PBS-Triton洗3次，每次3 min，在切片组织上滴加Ⅱ抗，室温避光孵育l h，再用PBS-Triton洗3次，每次3 min；然后用DAPI染核3 min，再用PBS-Triton洗3次，每次3 min；最后用抗荧光淬灭剂封片；荧光倒置扫描显微镜观察并拍照，ImageJ分析数据。TRAP呈绿色，SIRT1/NF-κB p65/NLRP3呈红色，DAPI细胞核呈蓝色，双染的共定位阳性细胞经叠加后呈黄色。

3.5 RT-qPCR检测股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表达 往100 mg大鼠股骨组织中加入Trizol试剂以制备RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，在7500型实时PCR系统上使用实时荧光定量试剂盒进行RT-qPCR。PCR扩增条件设置为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环40次。根据各组Ct值，通过2-ΔΔCt计算各组mRNA相对表达量，重复3次。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3.6 Western blot检测股骨组织中各组NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的蛋白表达 往100 mg大鼠股骨组织加入蛋白裂解液提取其总蛋白，后用BCA法测浓度，继之间上述蛋白样品进行电泳、转膜、封闭及加入Ⅰ抗（NF-κB p65、NLRP3和NFATc1抗体）摇床上孵育过夜，孵育条件设置为4 ℃；次日TBST洗膜后加入Ⅱ抗孵育，孵育条件设置为37 ℃ 1 h；TBST洗膜后按1∶1的比例在PVDF膜上滴加显影液，用凝胶成像分析系统拍照。用ImageJ软件进行处理与分析。

4 统计学处理

用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。符合正态分布和方差齐性检验的数据选择单因素方差分析；不符合正态检验条件的数据采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 TJC对PMOP大鼠一般状况和体重的影响

造模8周后（首次给药前），sham组饮食饮水如常，活动如常，反应灵敏，毛色光亮；OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJCL+OVX组大鼠进食饮水频繁、活动频率降低、反应欠灵敏（如抓取时）、垫料更换后浸湿速度增快。造模16周后（TJC干预8周后即末次给药后），sham组饮食饮水如常，活动如常，反应灵敏，毛色光亮；OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组大鼠活动频率明显减少，其中OVX、EX-527+OVX和TJC-L+OVX组大鼠毛发欠光泽、部分大鼠颈部背侧毛发出现脱落，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX组大鼠反应较好，毛发无明显脱落，进食量和饮水量饮水量稍有减少，尤以ESV+OVX组及TJC-H+OVX组大鼠上述一般状况的改善程度最为明显。

造模8周后（首次给药前），与sham组相比，OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJCM+OVX和TJC-L+OVX组大鼠体重均显著增加（P<0.05）。造模16周后（TJC干预8周后即末次给药后），与sham组相比，OVX和EX-527+OVX组大鼠体重显著增加（P<0.05）；与OVX组相比，ESV+OVX和TJC-H+OVX组大鼠体重均显著降低（P<0.05）；与EX-527+OVX组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX组大鼠体重均显著降低（P<0.05）。见图1。

Figure 1. Body weight changes of the rats in each group. Mean±SD. n=10. △P<0.05， △△P<0.01 vs sham group； *P<0.05， **P<0.01 vs OVX group； ▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.图1 各组大鼠体重变化结果

2 TJC对PMOP大鼠炎症因子含量的影响

与sham组相比，OVX和EX-527+OVX组大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著增加（P<0.01）；与OVX组相比，ESV+OVX和TJC-H+OVX组大鼠血清IL-1β含量显著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJCM+OVX组大鼠血清IL-18含量显著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组大鼠血清TNF-α含量显著降低（P<0.05）；与EX-527+OVX组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX组大鼠血清IL-1β和IL-18含量显著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组大鼠血清TNF-α含量也显著降低（P<0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清炎症因子含量变化比较Table 2. Comparison of serum content of inflammatory factors in each group （Mean±SD. n=10）

3 TJC对PMOP大鼠破骨细胞SIRT1、NF-κB p65和NLRP3荧光表达强度的影响

与sham组相比，OVX和EX-527+OVX组大鼠破骨细胞中SIRT1表达荧光面积显著降低，而NF-κB p65和NLRP3表达荧光面积显著升高（P<0.01）；与OVX组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组大鼠破骨细胞中SIRT1表达荧光面积显著升高，而NF-κB p65和NLRP3表达荧光面积显著降低（P<0.01）；与EX-527+OVX组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组大鼠破骨细胞中SIRT1表达荧光面积显著升高，而NF-κB p65和NLRP3表达荧光面积显著降低（P<0.01），见图2。

Figure 2. Immunofluorescence intensity changes of SIRT1， NF-κB p65 and NLRP3 in the osteoclast of each group. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs OVX group； ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.图2 各组大鼠破骨细胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3免疫荧光强度变化

4 TJC对PMOP大鼠股骨组织NF-κB p65、NLRP3和NFATc1 mRNA表达的影响

与sham组相比，OVX和EX-527+OVX组股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表达水平显著升高（P<0.01）；与OVX组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）；与EX-527组相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX组NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表达水平显著降低（P<0.01），见图3。

Figure 3. The mRNA expression of NF-κB p65， NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs OVX group； ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.图3 各组大鼠股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1 mRNA表达变化结果

5 TJC对PMOP大鼠股骨组织NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表达的影响

与sham组相比，OVX组和EX-527+OVX组股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表达明显升高（P<0.01）；与OVX组相比，ESV+OVX组和TJCH+OVX组NLRP3蛋白表达明显降低，ESV+OVX组和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX组NF-κB p65和NFATc1蛋白表达也均明显降低（P<0.05）；与EX-527+OVX组相比，ESV+OVX组和TJC-H+OVX NLRP3蛋白表达明显降低，ESV+OVX组和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX组NF-κB p65和NFATc1蛋白表达也均明显降低（P<0.05），见图4。

Figure 4. The protein expression of NF-κB p65， NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； *P<0.05， **P<0.01 vs OVX group； ▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.图4 各组大鼠股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表达变化结果

讨论

依据PMOP的主要病机“破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成”，目前临床上治疗PMOP的常用药物为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。骨吸收抑制剂包括雌激素、双膦酸盐和地诺单抗等；骨形成促进剂有钙剂、特立帕肽和阿巴帕肽等。这些西药治疗虽然能明显缓解患者的疼痛，减轻临床症状，但是存在一系列副作用。如雌激素长期服用会增加患者冠状动脉疾病、子宫内膜癌、乳腺癌和中风等疾病的发病率［19-22］。双磷酸盐长期服用患者会出现髋骨骨折、下颌骨坏死、胃肠道反应、低钙血症等副作用［23-25］。此外，大剂量的摄入钙可能导致便秘和肠胀气，也可增加心肌梗死和肾结石的患病风险［26］；特立帕肽则是患者在停药后疗效会迅速丧失［27-28］。因此，寻找新的治疗策略成为PMOP亟待解决的问题。据报道，某些补肾中药复方可以通过抑制破骨细胞分化来防止PMOP引起的骨代谢紊乱［29］。TJC作为补肾壮骨的代表方药，因在PMOP治疗中的潜在作用而备受关注。

已有大量研究表明，炎症反应是促进破骨细胞生成参与骨质疏松症的重要途径［30-31］。PMOP患者由于雌激素缺乏会出现促炎细胞因子如IL-1、TNF-α和IL-6等分泌增多现象，使破骨细胞增殖和活性增强，进而打破了骨形成与骨吸收之间的动态平衡［32］。有研究已证明IL-1和TNF-α受体缺失型小鼠进行OVX，术后这类小鼠不会出现骨丢失现象［33］，说明这些炎症因子和骨吸收密切相关。此外大量研究证明［34-36］，TNF、M-CSF、NFATc 1等因子可以调控破骨细胞的来源和分化，其中NFATc 1被认为是破骨分化的特异性调节器［37］。本研究发现OVX组大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌明显增多，股骨组织中NFATc1的mRNA和蛋白表达显著，说明在PMOP中炎症反应促进了破骨细胞分化，这与上述研究结果相似。而TJC干预后IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌显著降低，股骨组织中NFATc1的mRNA和蛋白表达显著降低，证明TJC通过抑制炎症因子的分泌正反馈抑制PMOP破骨细胞NFATc1的表达，最终达到抑制PMOP破骨细胞分化的目的。但是TJC通过抑制炎症因子的分泌正反馈抑制PMOP破骨细胞NFATc1的表达是通过什么样的网络信号来调控的，目前尚未具体阐明。

Gurt等［38］发现，SIRT1激活剂SRT2183能抑制破骨细胞分化成熟和功能，抑制了骨吸收过程。另有文献发现，橙皮苷升高SIRT1的表达可显着降低炎症介质NF-κB以及TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子水平，明显改善了骨丢失［39］。提示SIRT1可能是调控破骨细胞炎症反应的关键靶点。NF-κB信号通路是经典炎症信号通路，通过调控破骨细胞参与骨质疏松症的重要发生过程［40］。研究发现，SIRT1可通过抑制NF-κB信号通路阻止BMM向破骨细胞分化，从而抑制骨质疏松症的发生［9］。而NLRP3炎症小体激活的起始步骤也主要依赖于NF-κB通路，NF-κB抑制剂显著降低NLRP3炎症小体表达水平，缓解骨吸收［8］。NF-κB/NLRP3信号通路的激活刺激促炎细胞因子的产生［41］，因此，NF-κB、NLRP3炎症小体作为炎症的上游信号，可介导炎症反应的发生［42］。本实验发现在OVX组大鼠股骨组织中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表达显著上升，而TJC干预后NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表达显著降低；说明在OVX大鼠中激活NF-κB/NLRP3信号通路促进了NFATc1的生成，加速了破骨细胞的分化，而TJC逆转了这一现象。本实验也观察到OVX组大鼠破骨细胞中SIRT1荧光表达面积显著降低，而NF-κB p65和NLRP3的荧光表达面积显著升高；TJC干预后破骨细胞中SIRT1荧光表达面积显著上升，而NF-κB p65和NLRP3的荧光表达面积显著降低。这表明OVX大鼠可通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路介导炎症反应促进IL-1β、IL-18和TNF-α等炎症因子的释放，进一步促进破骨分化标志分子NFATc1的表达，从而促进OVX大鼠破骨细胞的分化。

综上所述，TJC通过调控SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路炎症因子的分泌来正反馈抑制破骨细胞分化标志分子NFATc1的表达，抑制PMOP破骨细胞的分化，从而纠正其骨代谢紊乱，为TJC防治PMOP的作用机制研究提供了实验证据。但目前研究仍然存在一些不足，本研究仅通过体内实验层面阐明了TJC抑制破骨细胞分化可能与SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路抑制有关，但在本研究中未使用SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路的相关抑制剂如SIRT1抑制剂，也未使用基因干扰技术并结合体外实验对TJC抑制破骨细胞分化的作用机制进行深入探讨。