不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分的对比分析

高必兴，齐景梁，马璐琳，苟琰，李倩，连艳，蒋桂华，蒋运斌（.四川省药品检验研究院/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，四川 成都 67；.成都市郫都区中医医院，四川 成都 670；.成都中医药大学药学院，四川 成都 6007；.西南大学药学院中医药学院，重庆 0075）

洪连又称“兔耳草”，被《四部医典》[1]列为藏草药之首，药用价值高。其中基原之一短筒兔耳草（LagotisbrevitubaMaxim）现收载于《中国药典》2020年版一部，具有清热解毒、利湿平肝、行血调经等作用，可用于发热烦渴、肺热咳嗽、头痛眩晕、湿热黄疸、月经不调等症[2]。《部颁藏药》收载了全缘兔耳草（L.integraW.W.Smith）[3]，其他地方标准[4-7]以药材名“兔耳草”或“洪连”收载了革叶兔耳草（L.alutaceaW.W.Smith）、短穗兔耳草（L.brachystachyaMaxim.）及圆穗兔耳草（L.ramalanaBatalin）。前期调查[8]发现，市售及临床使用的洪连均为兔耳草属多种植物，除上述标准收载的基原外，还有云南兔耳草（L.yunnanensisW.W.Smith.）及紫叶兔耳草（L.praecoxW.W.Smith）等基原在临床上也作洪连使用。

环烯醚萜苷类成分与苯丙素类成分均为玄参科兔耳草属植物的主要活性成分，具有明显的药理活性，与治疗热性肝病作用相合[9]。现有标准及文献针对苯丙素类成分的研究较多，而针对环烯醚萜苷类成分的研究甚少。相关标准中仅建立了针对苯丙素类成分的含量测定方法，《中国药典》2020年版一部中针对洪连（基原为短筒兔耳草）收载了以松果菊苷为指标成分的含量测定方法[2]，《四川省藏药材标准》2020年版[7]针对圆穗兔耳草建立了以松果菊苷及毛蕊花糖苷为指标成分的含量测定方法，所测成分均为苯丙素类。同时，洪连的苯丙素类成分（毛蕊花糖苷、松果菊苷、大车前苷及鞭打绣球苷B）的含量对比研究已报道[9-12]，但洪连的环烯醚萜苷类成分研究甚少。通过前期化学成分研究[9-13]发现，不同基原洪连含有梓醇、栀子新苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸、乔木状车前苷酸等环烯醚萜苷类成分，均为其主要的有效成分，但现有标准及文献均无相关报道，也无相关的定量研究。因此，本研究拟建立市售常用不同基原洪连的7种环烯醚萜苷类成分含量测定方法，并比较不同基原之间的成分种类及含量差异，为其质量控制及资源合理开发利用提供科学的依据。

1 仪器及试药

1290 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BP211D 十万分之一电子分析天平（德国Sartorious 公司）；XPR26 百万分之一电子分析天平（德国METTLER TOLEDO 公司）；Milli-Q Advantage A10 纯水仪（美国Millipore 公司）；HU20500D 型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；色谱柱：Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Hypersil GOLD aQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

梓醇（批号：111808-202112，纯度98.8%）、桃叶珊瑚苷（批号：111761-200601，使用前须使用P2O5干燥24 h，含量测定以100.0%计），中国食品药品检定研究院；京尼平苷酸，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-21062003，纯度98.98%；玉叶金花苷酸，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：RDD-Y26302112001，纯度98.0%；8-表马钱子苷酸，四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq22041208，纯度98.0%；栀子新苷（纯度98.63%）、乔木状车前苷酸（纯度92.81%），四川省药品检验研究院中成药重点实验室自制；甲醇和乙腈，美国Fisher公司，色谱纯。

共收集7种基原77批次洪连药材，包括短筒兔耳草19批，全缘兔耳草10批，圆穗兔耳草10批，云南兔耳草17 批，短穗兔耳草10 批，革叶兔耳草6 批及紫叶兔耳草5批，均经四川省药品检验研究院黎跃成主任中药师鉴定为基原准确的药材。所有采集药材均晒干。样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，0.2%→0.5% A；10～30 min，0.5%→2.0% A，30～60 min，2.0%→7.0%A；60～70 min，7.0%→12.0%A；70～80 min，12.0%→14.0% A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：205 nm（0～42 min）、236 nm（42～80 min）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取梓醇、桃叶珊瑚苷、栀子新苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸及乔木状车前苷酸对照品适量，精密称定，置同一25 mL 量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）溶解并定容至刻度，即得对照品溶液。各对照品的浓度分别为0.322 9、1.016 1、0.349 2、0.369 6、0.182 9、0.267 6、0.169 3 mg·mL-1。

2.1.3 供试品溶液的制备 取样品粉末（过3 号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷。再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液，精密量取10 mL，浓缩至近干。残渣用乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）溶解并定容至10 mL 量瓶中，摇匀并滤过，取续滤液。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系 精密吸取“2.1.2”项下各对照品储备液适量分别置于7 个10 mL 量瓶中，加乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混标溶液。以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标进行线性回归。结果表明，7 种化合物在一定质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好（r≥0.999 9）。各成分标准曲线的回归方程、线性范围及相关系数（r）见表2。

2.2.2 检测限与定量限测定 取“2.1.2”项下对照品溶液逐级稀释并测定，以色谱图中信噪比（S/N）3∶1为检测限，（S/N）10∶1 为定量限。结果表明，梓醇、桃叶珊瑚苷、栀子新苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸及乔木状车前苷酸的检测限分别为1.52、1.82、4.08、3.94、3.31、2.37、3.41 ng；定量限分别为5.07、6.07、13.61、13.14、11.03、7.92及11.36 ng。

2.2.3 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果梓醇、桃叶珊瑚苷、栀子新苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸及乔木状车前苷酸峰面积的RSD 分别为0.95%、0.78%、0.56%、0.34%、0.47%、0.86%及0.93%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性试验 取样品粉末（YN-1）6份，分别按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱方法测定，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的梓醇、桃叶珊瑚苷、栀子新苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸及乔木状车前苷酸峰面积的RSD 分别为0.67%、0.72%、0.64%、0.91%、0.74%、0.94%及0.33%，结果表明重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（YN-1），分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定。结果梓醇、桃叶珊瑚苷、栀子新苷、京尼平苷酸、玉叶金花苷酸、8-表马钱子苷酸及乔木状车前苷酸峰面积的RSD 分别为0.36%、0.27%、0.39%、0.41%、0.35%、0.47%及0.59%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.6 耐用性试验 取同一份供试品溶液（YN-1），分别使用3种不同色谱柱[Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Hypersil GOLD aQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]考察其耐用性，结果各峰分离度高，峰形好，耐用性高。色谱图见图2。

图2 3 种不同色谱柱的洪连样品色谱图Figure 2 Chromatograms of Lagotidis Herba on three different columns

2.2.7 加样回收率试验 精密称定各对照品适量，置量瓶中，加甲醇溶解，并配制成相应的对照品溶液。精密称定已知含量的YN-3 样品6 份，每份约0.125 g，分别精密加入上述对照品溶液适量，按照“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率。结果回收率为99.5%～101.5%，RSD为0.65%～1.94%，表明该方法加样回收试验结果良好。结果见表3。

表3 洪连样品的加样回收率试验（n=6）Table 3 Recovery test of Lagotidis Herba（n=6）

2.2.8 样品含量测定 称取77 批次洪连样品粉末各0.25 g，精密称定，分别按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱方法测定，记录7 种成分的峰面积，计算含量。结果见表4。

表4 不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分测定结果（n=2）Table 4 Determination of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins（n=2）

2.2.9 含量范围及平均值分析 7 种基原各成分的含量范围及平均值如表5所示，从成分种类来看，短筒兔耳草、紫叶兔耳草及全缘兔耳草均不含京尼平苷酸；短筒兔耳草、圆穗兔耳草、革叶兔耳草及紫叶兔耳草均不含乔木状车前苷酸；从含量范围上来看，7种基原各成分的含量均存在着一定的交叉，差异性不明显；从平均值上来看，云南兔耳草环烯醚萜苷类的总成分含量最高，而梓醇以紫叶兔耳草含量最高，桃叶珊瑚苷以短穗兔耳草含量为最高。

表5 不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分含量范围及平均值（n=2）Table 5 Content range and average value of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins（n=2）

2.2.10 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14.1统计软件，先对数据（包括单体成分含量及总含量数据）进行分类识别，然后进行OPLS-DA分析。使用无监督模式识别，观测样品的聚集。结果见图3。圆穗兔耳草、短筒兔耳草、紫叶兔耳草及革叶兔耳草聚为一类；全缘兔耳草及短穗兔耳草聚为一类，云南兔耳草独自聚为一类。

图3 不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分OPLS-DA 得分图Figure 3 OPLS-DA score diagram of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba form different origins

变量重要性投影（VIP）值是筛选差异性化合物的重要指标，VIP值越高，对组间差异的影响越大，以变量VIP 值＞1.0 为影响显著[14]。结果显示，乔木状车前苷酸及梓醇为显著影响，其他化合物对区分样品影响较小。VIP值由大到小进行排序，分别为乔木状车前苷酸＞梓醇＞桃叶珊瑚苷＞京尼平苷酸＞玉叶金花苷酸＞8-表马钱子苷酸＞总含量＞栀子新苷。结果见图4。

图4 不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分的变量重要性投影（VIP）值Figure 4 Variable importance projection（VIP）values of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins

3 讨论

本研究对不同基原洪连中7种环烯醚萜苷类成分的色谱条件与系统适用性、供试品溶液制备进行了优化。检测波长在190～700 nm 处进行紫外-可见光全波长扫描，发现梓醇及桃叶珊瑚苷最大吸收波长低于200 nm，故选择稳定性相对较高的205 nm 作为此2 种成分的检测波长；栀子新苷、京尼平苷酸、8-表马钱子苷酸、玉叶金花苷酸及乔木状车前苷酸最大吸收波长为236～238 nm，故选择其测定波长为237 nm。因梓醇、桃叶珊瑚苷与其余5 种化合物的最大吸收波长不一致，故选择变换波长的方法进行含量测定。针对流动相系统及比例，考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.2%磷酸溶液，并考察了柱温及梯度洗脱条件，最终显示以“2.1.3”项下所述的方法为佳。供试品溶液的制备针对了样品的提取溶剂、提取方式、提取时间及料液比进行了考察，最终确定“2.1.1”项下所述的方法。

据相关报道[8-12]及调研发现，洪连常分为“雌洪连”及“雄洪连”，圆穗兔耳草、短筒兔耳草及紫叶兔耳草同属于“雄洪连”，云南兔耳草、全缘兔耳草及革叶兔耳草常属于“雌洪连”，“雄洪连”的临床疗效优于“雌洪连”[15]。而短穗兔耳草常作藏药“直打瓦曾”使用，在藏区主要用于治疗“黄水病”[16]，与2020年版《中国药典》一部记载“洪连”的功效差异较大。本研究的指标成分为环烯醚萜苷类成分，为洪连治疗热性肝病的有效成分。从本实验结果可知，各基原环烯醚萜苷成分存在着共性及差异性，单体在种类上存在着一定的差异，同一单体在部分基原含量上存在着一定的交叉，成分总含量上不具规律性。通过OPLS-DA 得分图可知，圆穗兔耳草、短筒兔耳草及紫叶兔耳草聚为一类，从环烯醚萜苷类成分验证了三者为“雄洪连”的依据；全缘兔耳草及短穗兔耳草聚为一类，云南兔耳草独自聚为一类，说明从“雄洪连”“雌洪连”“直打瓦曾”的角度来看，“雄洪连”与“雌洪连”成分差异较大。与相关报道[12]“雄洪连”与“雌洪连”在苯丙素苷类的种类及含量上存在着较明显的差异性的说法相似。同属“雌洪连”3个基原成分差异大，部分基原又与“直打瓦曾”相似。故“雄洪连”的临床疗效优于雌洪连，以及“直打瓦曾”是否能替代“洪连”使用仍需深入的药效学研究。调研发现，云南兔耳草在各藏区使用频率高，本研究结果表明云南兔耳草各单体的总含量最高，但在现有标准[2-7]中，该基原并未被收载。同时紫叶兔耳草也未被收载。

本研究针对洪连的特征有效成分环烯醚萜苷类进行定量研究，比较了不同基原洪连的共性及差异性，弥补了不同基原洪连中环烯醚萜苷类成分含量对比研究的空白，满足了藏药复杂成分体系的质量控制要求，可为其质量标准的建立和提高打下基础。