松郁安神方通过海马NLRP3炎性小体通路改善慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的研究

曾雪爱，周春权，郭昕子，张瑜，张敏，张一帆，陈铭奇，黄俊山（.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；.福建中医药大学，福建 福州 350003）

睡眠剥夺是由于环境或自身原因所引起的睡眠时间减少或者睡眠质量下降[1]。随着生活节奏加快，夜间生活时间延长，睡眠时间缩短，越来越多的人群出现不同程度的睡眠剥夺。睡眠剥夺能引起广泛的机体损伤，例如增加大脑神经性疾病、心血管疾病、肠道稳态失衡和其他多器官疾病的发病率、死亡率[2]。长期睡眠不足会直接导致学习记忆能力下降，因此针对睡眠剥夺进行积极干预具有重要意义。近年来，越来越多的证据揭示NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domian associated protein 3，NLRP3）炎性小体在睡眠障碍、学习记忆障碍、认知损害中发挥了重要作用，其能够诱导促炎性细胞因子白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）、IL-1β 等的成熟和分泌，从而促进炎症反应发生[3-4]。

松郁安神方是本课题组在临床上针对肝郁化火、阴虚火旺型失眠创立的经验方，具有疏肝解郁、平肝潜阳、宁心安神的功效，临床疗效确切[5-6]。本课题组前期研究显示，松郁安神方具有改善失眠大鼠睡眠及学习记忆的作用[7-9]，可降低睡眠剥夺大鼠血清促炎性细胞因子IL-1β的表达水平[10]，但其调节睡眠改善学习记忆的潜在作用机制仍需进一步研究。故本研究拟通过慢性睡眠剥夺建立失眠大鼠模型，探讨松郁安神方对NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）及其下游促炎性细胞因子IL-1β、IL-18 的影响，揭示其改善睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级雄性SD 大鼠，2月龄，体质量200～220 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，动物质量合格证号：110300000100882563。动物置于安静、室温25～26 ℃、相对湿度50%～60%、12 h/12 h 明暗光照环境中饲养，自由饮水、摄食。本实验经福建省中医药科学院实验动物伦理委员会批准，批文号：FJATCM-IAEC2022002。

1.2 药物及试剂松郁安神方组成：甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、丹参15 g、酸枣仁15 g、首乌藤30 g、珍珠母30 g、生龙骨30 g、合欢皮15 g，饮片均购于福州鹭燕药业股份有限公司，经福建中医药大学药学院范世明教授鉴定为正品。按照前期研究[9]方法制备松郁安神方药液，经煎煮、过滤后浓缩至含生药3.4 g·mL-1浓度，4 ℃保存。IL-1β（批号：R11013726）、IL-18（批号：R10013725）ELISA 检测试剂盒，均购自武汉华美生物工程有限公司；NLRP3抗体（批号：1007080-14）、ASC 抗体（批号：1031305-6），均购自英国Abcam 公司；Caspase-1 抗体，武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司，批号：5500014099；β-tubulin 抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：LS20380；β-actin 抗体（批号：4970-14）、辣根过氧化物酶标记二抗（批号：7074-27），均购自美国Cell Signaling Technology 公司；ECL 化学发光液，美国Thermo 公司，批号：UD281581。

1.3 主要仪器SBZ-2 型动物睡眠剥夺装置，中国医学科学院药物研究所研制；MT-200型Morris 水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司；Elx800TS 型酶标仪，美国Bio-Tek 公司；NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度计，美国Thermo 公司；蛋白电泳和电转仪，美国Bio-Rad 公司；FluorChem M型Alpha 多色荧光、化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司。

1.4 分组、模型复制及给药将SD 大鼠随机分成正常组（8 只）、大平台组（8 只）、睡眠剥夺组（32 只）。睡眠剥夺组采用改良多平台水环境法进行慢性睡眠剥夺模型复制[11-12]：将大鼠放入睡眠剥夺装置，内有多个小平台，平台直径6.5 cm，周围注满水，平台高于水面约1.0 cm；当大鼠进入快速眼动（Rapid eyes movement，REM）睡眠时，因全身肌肉张力降低，出现垂头触水而觉醒，从而达到睡眠剥夺的目的。每日14∶00 至次日10∶00 进行睡眠剥夺20 h，然后恢复睡眠4 h，连续剥夺21 d。正常组大鼠常规饲养，大平台组采用与睡眠剥夺组一样的装置，仅把大鼠放在直径为12 cm的大平台上，保证动物在大平台上能够进入REM 睡眠，其他环境与睡眠剥夺组完全一致。若造模大鼠出现白天精神亢奋、易激惹，昼夜节律消失，与正常组比较体质量显著下降，则表明模型复制成功。

模型复制成功后，将睡眠剥夺组大鼠随机分为模型组及松郁安神方高、中、低剂量组，每组8只。松郁安神方高、中、低剂量组每天分别按照34、17、8.5 g·kg-1剂量灌胃，给药剂量按大鼠与成人给药剂量换算[13]。正常组、大平台组、模型组均给予同等体积蒸馏水灌胃，每天1次，连续7 d。

1.5 大鼠一般状态观察造模及给药期间观察记录各组大鼠的活动程度、昼夜节律、皮肤毛发、精神状态、饮食饮水量及体质量等一般情况。

1.6 Morris 水迷宫法测定大鼠学习记忆能力造模前先进行Morris 水迷宫训练，连续训练3 d。造模第21 天和给药后第7 天均进行定位航行和空间搜索试验。采用定位航行试验测试大鼠对水迷宫的学习记忆能力：将大鼠分别从4个不同象限入水，用软件记录大鼠找到隐藏在水面下平台的时间（逃避潜伏期）以及到达平台的游泳总距离，取4次平均值。若大鼠120 s内未找到平台，则逃避潜伏期记为120 s，以此作为判断大鼠学习记忆能力的指标。采用空间搜索试验测试大鼠对平台空间位置的记忆能力：定位航行实验结束后休息半天，撤去平台，然后从任意选择的一个象限入水，记录120 s内大鼠在目标象限的停留时间和穿越原平台位置的次数。

1.7 ELISA 法检测海马组织中IL-1β、IL-18 含量水迷宫测试结束后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）麻醉，冰面上迅速剥离脑组织；收集海马组织，按照1∶9 的质量体积比加入PBS，冰上匀浆；以4 ℃、5 000×g离心10 min，取上清；严格按照检测试剂盒说明书步骤操作，测定海马组织中IL-1β、IL-18含量。

1.8 Western Blot 法检测海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达水平取大鼠海马组织，加裂解液匀浆提取总蛋白。蛋白定量后进行凝胶电泳、转膜、封闭。分别用一抗NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、β-tubulin（1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜；然后用辣根过氧化酶标记的二抗（1∶10 000）在室温下孵育1 h；最后用ECL 化学发光试剂显影，凝胶成像系统扫描；采用ImageJ 图像分析软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin/β-tubulin为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.9 统计学处理方法采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD（方差齐性）检验或Dunnett’s T3（方差不齐）检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠体质量的影响结果见图1。正常组和大平台组比较，体质量无明显变化（P＞0.05）。造模期间，与大平台组比较，睡眠剥夺组大鼠体质量增加缓慢（P＜0.01）。药物治疗7 d后，与模型组比较，松郁安神方高、中、低剂量组大鼠的体质量增加量均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠的体质量变化（±s，n=8）Figure 1 Body mass changes of rats in each group（±s，n=8）

2.2 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的影响结果见图2、图3、图4。正常组和大平台组比较，学习记忆能力无明显变化（P＞0.05）。21 d 睡眠剥夺后，与大平台组比较，睡眠剥夺组大鼠的逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），到达平台的总距离显著增加（P＜0.01），穿越平台的次数及目标象限停留时间显著减少（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 睡眠剥夺21 d 后大鼠学习记忆能力的变化（±s，n=8）Figure 2 Changes in learning and memory ability in 21-day sleep-deprived rats（±s，n=8）

图3 水迷宫实验的大鼠运动轨迹图Figure 3 Movement plot of rats in the water maze test

图4 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的影响（±s，n=8）Figure 4 Effects of Songyu Anshen Prescription on learning and memory ability of chronic sleep-deprived rats（±s，n=8）

药物治疗7 d 后，与模型组比较，松郁安神方高、中剂量组大鼠的逃避潜伏期及到达平台的总距离明显缩短（P＜0.05），穿越平台的次数及目标象限停留时间显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，慢性睡眠剥夺后大鼠的学习记忆能力明显下降，而松郁安神方能提高慢性睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力。

2.3 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 水平的影响结果见图5。正常组和大平台组比较，大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 含量无明显变化（P＞0.05）。与大平台组比较，模型组大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 含量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，松郁安神方高、中剂量组大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，慢性睡眠剥夺模型大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 含量明显升高，而松郁安神方能降低模型大鼠海马组织中的IL-1β、IL-18水平。

图5 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 水平的影响（±s，n=6）Figure 5 Effects of Songyu Anshen Prescription on levels of IL-1β and IL-18 in hippocampus of chronic sleep-deprived rats（±s，n=6）

2.4 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达的影响结果见图6。正常组与大平台组比较，大鼠海马组织NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与大平台组比较，模型组大鼠海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达均明显上调（P＜0.05）。与模型组比较，松郁安神方高、中剂量组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1 蛋白表达均显著下调（P＜0.05，P＜0.01），松郁安神方高剂量组大鼠海马组织中ASC 蛋白表达明显下调（P＜0.05）。结果表明，慢性睡眠剥夺模型大鼠海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达量明显增加，而松郁安神方能抑制模型大鼠NLRP3炎性小体的表达。

图6 松郁安神方对慢性睡眠剥夺大鼠海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达的影响（±s，n=5）Figure 6 Effects of Songyu Anshen Prescription on protein expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in hippocampus of chronic sleepdeprived rats（±s，n=5）

3 讨论

多平台水环境法是剥夺大鼠睡眠的常用方法，该方法可完全剥夺大鼠快速眼动（REM）睡眠，有效阻止其进入深睡眠。研究[14-15]表明，睡眠对学习记忆有重要作用，睡眠剥夺可引起大鼠学习记忆能力下降。本实验通过多平台水环境法建立了慢性睡眠剥夺失眠大鼠模型，结果发现，睡眠剥夺21 d 后，大鼠昼夜节律消失，毛发枯槁，体质量明显下降；进一步通过水迷宫测试发现，模型大鼠的学习记忆能力明显下降，表现为逃避潜伏期显著延长，找到安全平台的距离显著增加，穿越平台次数和目标象限停留时间明显减少。上述结果表明，该模型能较好地模拟失眠疾病的病理状态。

睡眠是巩固学习记忆以及维持免疫系统平衡的重要生理过程。睡眠剥夺可诱发中枢神经系统炎症反应，增加脑内促炎性细胞因子1L-1β 分泌，引起神经元损伤，造成学习和记忆能力下降[14-15]。海马组织是介导应激反应的重要脑区，也是应激激素作用的主要靶区，同时参与学习和记忆的优化、巩固。有研究[16-17]提示，睡眠剥夺能够通过不同途径损害神经突触可塑性，尤其是海马区神经元的可塑性，进而损害海马依赖性的学习记忆功能。本研究结果发现，睡眠剥夺后，模型组大鼠海马组织中IL-1β、IL-18 含量明显升高，而给予松郁安神方治疗后IL-1β、IL-18含量明显下降。结果提示，松郁安神方可能通过影响促炎性细胞因子IL-1β、IL-18 表达，调节海马突触可塑性，从而改善学习记忆能力。

近年来研究[18]发现，NLRP3炎性小体在机体免疫炎症反应中具有重要作用，其由胞内固有免疫受体NLRP3、ASC 和Caspase-1 的前体组成，其中NLRP3 通过识别配体和危险信号，ASC 募集和激活效应蛋白，并与Caspase-1前体结合。Caspase-1是炎性小体的重要组成物质，参与下游促炎性细胞因子IL-1β、IL-18 的成熟和释放，诱导炎症及免疫反应[19]。本研究结果发现，睡眠剥夺后模型大鼠海马组织中NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表达明显上调，提示睡眠剥夺与大鼠海马组织炎症反应相关。而给予松郁安神方治疗后，NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表达均明显下调，提示松郁安神方可能通过抑制NLRP3炎性小体激活，减轻海马组织炎症反应。

综上所述，松郁安神方可能通过抑制NLRP3炎性小体通路来调控促炎性细胞因子IL-1β、IL-18 的合成释放，从而减轻睡眠剥夺大鼠的海马组织炎性反应，从而改善其学习记忆能力。本研究结果部分揭示了松郁安神方改善睡眠剥夺引起学习记忆障碍可能的分子机制，可为临床治疗睡眠障碍引起的认知功能障碍提供科学依据，具有一定的临床应用价值。但松郁安神方是否还通过其他信号通路共同发挥改善学习记忆能力的作用仍有待进一步深入研究。