知母、干姜对PI3K/AKT通路异常激活介导的非小细胞肺癌吉非替尼耐药的影响及机制研究

余娅娅，朱燕娟，3，4，肖真真，马长菊，丁丽娜，雷尘静，刘译鸿，常雪松，陈亚栋，张海波，3，4，6（1.广州中医药大学第二附属医院肿瘤科，广东 广州 10120；2.广东省中医院肿瘤科，广东 广州 10120；3.广东省中医证候临床研究重点实验室，广东 广州 10120；4.粤港澳中医药与免疫疾病研究联合实验室，广东 广州 10120；.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 10120；6.省部共建中医湿证国家重点实验室，广东 广州 10120）

肺癌是发生率和死亡率最高的肿瘤之一[1]，其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最主要的肺癌类型，占全部肺癌的80%。以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是治疗晚期EGFR 敏感突变NSCLC 的一线药物。然而，20%～30% EGFR 敏感突变的NSCLC 患者因为存在原发耐药而缺乏有效治疗，且所有初治有效的患者也会在用药10 个月左右发生获得性耐药，使得EGFR-TKIs 的临床获益受限[2]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）通路异常活化是除EGFR T790M突变之外，最常见的EGFR-TKIs 耐药机制之一[3]。PTEN 缺失、PIK3CA 突变、MET 和ErbB2 扩增等都是EGFR-TKIs耐药的重要机制，均能促进PI3K/AKT 通路的异常活化[4]。目前，PI3K/AKT通路异常活化介导的EGFRTKIs耐药尚缺乏有效的临床治疗方法[5]。因此，寻找能有效逆转PI3K 通路异常活化导致肺癌EGFR-TKIs耐药的新方法具有重要的临床意义。

中药联合EGFR-TKIs 应用广泛，然而并非所有中药都适合与EGFR-TKIs 联合使用。有研究[6]显示，高丽参甚至会加速NSCLC 患者的EGFR-TKIs 耐药。中药与EGFR-TKIs 联合需在中医“理—法—方—药”诊疗原则的指导下应用。本课题组前期临床观察[7]数据显示，EGFR 突变的NSCLC 患者初诊时以寒证居多，EGFR-TKIs 治疗后会发生由寒转热的证候改变，而发生耐药时则以热证为主。结合EGFRTKIs 治疗后患者出现痤疮样皮疹、舌红、口干、尿黄等“热证”变化，提示EGFR-TKIs 具有类似中药的“温阳”作用。本课题组前期研究[8]显示，热毒证与PIK3CA突变密切相关，是EGFR-TKIs治疗的不良预后因素。PIK3CA 会导致PI3K 异常激活，在PI3K异常活化介导的耐药NSCLC 中，明确EGFR-TKIs 应与哪类中药联合使用具有重要意义。

知母具有清热泻火、滋阴润燥的功效，以及抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等药理作用[9]。干姜具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效，以及抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[10]。知母、干姜均是临床抗癌治疗的常用中药。故本研究拟以知母、干姜分别作为清热和温阳治则的代表中药，联合RGFR-TKIs 代表药物吉非替尼，探索寒、热不同药性中药对PI3K/AKT通路异常激活介导的耐药肺癌细胞生长及代谢的影响。

肿瘤细胞的生存、增殖和分化依赖于与特定细胞外基质成分的相互作用，细胞外基质的作用在二维（2D）单层细胞培养中不能很好再现，而三维（3D）球体模型概括了体内形态如细胞极化、细胞层组织、与细胞外基质的相互作用，更能反映体内真实情况[12]。因此，本研究将选择前期已成功构建的PC-9-PIK3CA-Mutation（PC-9-PIK3CA-M，EGFR 19 外显子突变合并PIK3CA 突变）-3D 细胞[11]和H1650（EGFR突变合并PTEN 缺失）-3D 细胞作为吉非替尼耐药模型。

1 材料与方法

1.1 细胞人非小细胞肺癌PC-9 细胞，由中山大学（广州）实验动物中心细胞库提供；H1650 细胞株（货号：CC0211），购自广州赛库生物技术有限公司。PC-9-PIK3CA-M 细胞培养：由本课题组通过慢病毒转染的方式将PIK3CA E545K 突变基因转染至PC-9细胞（EGFR 19 外显子突变）构建，细胞的吉非替尼耐药性已得到了证实[11]。

1.2 药物及试剂吉非替尼（批号：S1025），美国Selleck 公司；知母（批号：2008001）、干姜（批号2011001），佛山岭南中药饮片有限公司。DMEM/F12培养基（批号：2323289）、B27（批号：2301953）、0.25%胰酶（批号：2169109），美国Gibco 公司；表皮生长因子（EGF，批号：1021AFC05）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，批号：0216571），美国PeproTech 公司；基质胶（批号：0343001）、Cell Recovery Solution（批号：2161003），美国Corning 公司；嘌呤霉素（批号：QR12583），美国Mpbio 公司；Y-27632（批号：M1817-19），美国AbMole 公司；CellTiter- Glo®3D Cell Viability Assay（ 批号：0000514473），美国Promega公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒（批号：1271578），美国BD 公司；HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper，批号：7E581K1）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（批号：027E2201CD），南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Mitochondrion Staining Kit（线粒体染色试剂，批号：239098）、Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit（荧光法胞内总ROS检测试剂盒，批号：292084）、Fluorimetric Mitochondrial Superoxide Activity Assay Kit（荧光法线粒体超氧化物活性检测试剂盒，批号：2781782），美国AAT Bioquest公司。

1.3 主要仪器FreeZone 型真空冷冻干燥机，美国LABCONCO 公司；IC1000 型Countstar 自动细胞计数仪，美国Inno-Alliance Biotech公司；ECLIPSE Ti2-E型全自动倒置显微镜，日本尼康公司；SYNERGY H1型多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司；Quanteon流式细胞分析仪，美国ACEA 公司；LSM710 型激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司。

1.4 中药冻干粉制备分别取中药知母、干姜105 g，各加入1 050 mL 纯水浸泡30 min；煎煮至沸腾后转文火煎煮45 min，收集药液；再加入500 mL 纯净水，煎煮沸腾后转文火煎煮45 min；合并2 次煎液，纱布过滤后浓缩至约100 mL；浓缩液在-80 ℃冰箱中冷冻过夜后，置于真空干燥仪中干燥；收集冻干粉并称质量，每42.4 mg 知母冻干粉含生药1 g，每76.85 mg 干姜冻干粉含生药1 g。用RPMI-1640 培养基配制浓度为100 mg·mL-1的中药冻干粉母液，以0.22 μm针头滤器过滤除菌，4 ℃下保存备用。

1.5 细胞3D 培养将处于对数生长期的PC-9-PIK3CA-M 和H1650 细胞消化重悬后，按照细胞悬液∶基质胶=1∶1的比例混合均匀；根据不同实验方案配制不同细胞浓度和体积的胶滴，于37 ℃下将培养箱倒置30 min；待基质胶固化后，加入3D 细胞培养基（DMEM/F12、20 ng·mL-1EGF、10 ng·mL-1bFGF、5 μmol·L-1Y-27632、1× B27）；在37 ℃、5% CO2环境下培养，每2～3 d 更换1 次培养基。PC-9-PIK3CA-M 细胞用2.5 μg·mL-1嘌呤霉素维持培养。每天对3D 细胞进行观察，并分别在培养第4、5、7 天对NSCLC-3D细胞进行拍照。

1.6 细胞分组NSCLC-3D 细胞直径长到50～100 μm后进行分组：对照组、知母组、干姜组、吉非替尼组、吉非替尼+知母组、吉非替尼+干姜组。采用ATP 法检测3D-细胞活性后，选择吉非替尼和知母（或干姜）联用的最佳联合效应浓度，用于后续实验。

1.7 ATP 法检测细胞活性（1）以每10 μL 基质胶5×103个细胞的密度将PC-9-PIK3CA-M、H1650细胞铺于384 孔板孔底；培养7 d 后给药，分别给予0、10、20、40、80 μmol·L-1浓度的吉非替尼处理3D 细胞；24 h 后弃去培养基，用DMEM/F12 与CellTiter-Glo®3D细胞活性检测试剂按1∶1比例配制ATP反应液，每孔加入50 μL ATP反应液，室温下孵育30 min后，采用多功能酶标仪读取化学发光值；根据化学发光值计算：细胞活率（%）=实验组化学发光值/对照组化学发光值×100%；最后，计算出吉非替尼的IC50值。（2）分别按照“1.6”项下分组处理细胞，吉非替尼浓度选择IC50值（或IC50值附近）浓度进行干预，知母、干姜分别给予800、1 600、3 200、6 400 μg·mL-1浓度进行干预；采用ATP 法检测细胞活率，操作方法同前。

1.8 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡情况以每50 μL 基质胶2.5×104个细胞的密度将PC-9-PIK3CA-M、H1650 细胞接种于24 孔板中；培养7 d后给药，按照“1.6”项下分组进行药物干预；培养24 h 后弃上清，用Cell Recovery Solution 溶解基质胶，收集3D 细胞团；以不含EDTA 的胰酶将细胞团消化成单细胞悬液后，用完全培养基终止消化；以1 000 r·min-1（离心半径=16 cm）离心10 min，弃上清；PBS 清洗1 次后，重悬于300 μL Binding Buffer；每孔加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温下避光孵育15 min；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率（%，早期凋亡率+晚期凋亡率）。

1.9 ROS 荧光探针法检测细胞ROS 水平以每20 μL基质胶1×104个细胞的密度将PC-9-PIK3CA-M、H1650 细胞接种于共聚焦8 孔细胞板中；培养7 d后，按照“1.6”项下分组进行给药干预；24 h 后弃上清，加入提前配制好的1×检测混合液，每孔200 μL，室温下避光孵育2 h；采用激光共聚焦显微镜系统的FITC、TRITC、Cy5荧光通道拍照。其中以MitoliteTMDeep Red FX660 标记线粒体、ROS BriteTM570 标记胞内ROS、MitoROSTM520 标记线粒体超氧化物。

1.10 统计学处理方法采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。用Q值法计算药物之间的联合效应，当Q＜1，表示药物之间有拮抗作用；当Q＝1，表示两种药物有相加作用；当Q＞1，表示药物之间有协同作用。

2 结果

2.1 NSCLC-3D 细胞形成结果见图1。分别在培养第4、5、7 天对NSCLC-3D 细胞进行拍照，第7 天PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 细胞团直径长至50～100 μm，可以进行后续实验。

图1 PC-9-PI3CA-M-3D 与H1650-3D 细胞形成Figure 1 Morphology of PC-9-PI3CA-M-3D and H1650-3D cells

2.2 吉非替尼联合中药（知母或干姜）对NSCLC-3D细胞活力的影响结果见图2。在PC-9-PIK3CA-M-3D和H1650-3D细胞中，与对照组比较，10～80 μmol·L-1吉非替尼能显著抑制细胞活力（P＜0.01）。PC-9-PIK3CA-M-3D细胞的吉非替尼IC50值为21.26 μmol·L-1，H1650-3D 细胞的吉非替尼IC50值为23.33 μmol·L-1，均在20 μmol·L-1左右，故后续实验选择20 μmol·L-1吉非替尼分别与知母或干姜联合使用。

图2 吉非替尼联合中药对PC-9-PIK3CA-M-3D、H1650-3D 细胞活性的影响（±s，n=3）Figure 2 Effects of Gefitinib combined with Chinese medicinals on the cell viability of PC-9-PIK3CA-M-3D and H1650-3D cells（±s，n=3）

在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 细胞中，与吉非替尼组比较，吉非替尼+知母能显著抑制细胞活力（P＜0.01），且吉非替尼联合知母的Q值均在1 以上，即知母与吉非替尼有协同作用，当知母的浓度为3 200 μg·mL-1时，二者的协同效用最大。

在PC-9-PIK3CA-M-3D 细胞中，与吉非替尼组比较，吉非替尼+干姜能显著促进细胞活力（P＜0.05），当干姜浓度≤3 200 μg·mL-1，吉非替尼联合干姜的Q值均在1以下，即干姜与吉非替尼有拮抗作用，当干姜的浓度为3 200 μg·mL-1时，二者的拮抗作用最明显。

在H1650-3D细胞中，与吉非替尼组比较，吉非替尼+干姜能显著促进细胞活力（P＜0.01），吉非替尼联合干姜的Q值均在1以下，即干姜与吉非替尼有拮抗作用，且当干姜的浓度为3 200 μg·mL-1时，二者的拮抗作用最明显。

结果表明，知母能协同促进吉非替尼的抗肿瘤作用，而干姜则拮抗吉非替尼的抗肿瘤作用。当中药冻干粉浓度为3 200 μg·mL-1，吉非替尼浓度为20 μmol·L-1时，协同或拮抗作用最明显，可用于后续实验。

2.3 吉非替尼联合中药（知母或干姜）对NSCLC-3D细胞凋亡的影响结果见图3。在PC-9-PIK3CA-M-3D细胞中，与对照组比较，吉非替尼对细胞凋亡无显著影响（P＞0.05），吉非替尼+知母能显著促进细胞凋亡（P＜0.01），而吉非替尼+干姜能显著抑制细胞凋亡（P＜0.05）；与吉非替尼组比较，吉非替尼+知母能显著促进细胞凋亡（P＜0.01）。

图3 吉非替尼联合中药对PC-9-PIK3CA-M-3D、H1650-3D 细胞凋亡的影响（±s，n=3）Figure 3 Effects of Gefitinib combined with Chinese medicinals on the cell apoptosis of PC-9-PIK3CA-M-3D and H1650-3D cells（±s，n=3）

在H1650-3D细胞中，与对照组比较，吉非替尼和吉非替尼+干姜对细胞凋亡无显著影响（P＞0.05），吉非替尼+知母可显著促进细胞凋亡（P＜0.01）；与吉非替尼组比较，吉非替尼+知母可显著促进细胞凋亡（P＜0.01）。

结果表明，在3D 细胞培养条件下，吉非替尼对细胞凋亡的调控作用并不显著，而知母联合吉非替尼能促进细胞凋亡。干姜在两株细胞中则有不同表现，在PC-9-PIK3CA-M-3D 细胞中，干姜联合吉非替尼对肿瘤细胞显示出抑制凋亡作用，而在H1650-3D细胞中，干姜联合吉非替尼对凋亡的作用不明显。

2.4 吉非替尼联合中药对NSCLC-3D 细胞ROS 水平的影响结果见图4。在PC-9-PIK3CA-M-3D 细胞中，与对照组比较，吉非替尼组细胞线粒体ROS 水平明显降低（P＜0.05）；在H1650-3D 细胞中，与对照组比较，吉非替尼组细胞线粒体ROS 水平无明显变化（P＞0.05）。

在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 细胞中，与对照组比较，吉非替尼+知母组细胞粒体ROS水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），吉非替尼+干姜组细胞线粒体ROS水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与吉非替尼组比较，吉非替尼+知母组细胞线粒体ROS水平显著升高（P＜0.01）。结果表明，知母联合吉非替尼可以促进NSCLC-3D 细胞线粒体ROS 水平升高，而干姜联合吉非替尼则会抑制线粒体ROS水平。

3 讨论

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFRTKIs）开创了非小细胞肺癌（NSCLC）分子靶向治疗的先河，然而EGFR-TKIs 的耐药问题在很大程度上限制了患者的临床获益。T790M 突变是EGFR-TKIs 耐药的最重要原因，其次PI3K/AKT通路异常激活是关键的耐药机制之一。尽管该通路作为三大经典信号通路之一，对细胞生物学的影响及调控机制已被广泛研究，然而针对该通路诱导的耐药问题尚缺乏安全有效的治疗方法[13]。西医的研究策略主要集中在通路抑制剂的研发，包括PI3K 抑制剂、下游靶点AKT抑制剂和mTOR抑制剂，但目前上述新药在肺癌领域的有效性和安全性方面仍面临着较大挑战[14-15]。本研究通过联合清热药知母及温阳药干姜干预发现，清热中药知母能显著增强吉非替尼在3D 培养条件下对PC-9-PIK3CA-M 和H1650 细胞活力的抑制，并促进细胞凋亡，为逆转PI3K/AKT通路异常激活介导的EGFR-TKIs 耐药提供了一种新的治疗策略，具有一定的临床意义。

本课题组前期实验[7]及相关研究[16]发现，EGFRTKIs 具有“温阳”属性，PIK3CA 突变与中医热毒证密切相关，二者均是EGFR-TKIs 预后不良的因素。药物各具偏性，“过用”亦能致病，具有“温阳”作用的EGFR-TKIs用于合并热毒证的PIK3CA突变患者会发生耐药。PI3K 异常激活是EGFR-TKIs 耐药的重要机制之一，PIK3CA能够促进PI3K/AKT通路异常激活。因此，本课题组根据中医“热者寒之”的理论提出假设，清热类药物能逆转PI3K/AKT通路异常激活介导的EGFR-TKIs 耐药，并选用EGFR 敏感突变合并PTEN缺失或PIK3CA突变的NSCLC细胞结合3D培养技术，建立了PI3K异常活化介导EGFR-TKIs 耐药的细胞模型。知母是清热滋阴类中药，具有抗癌药理作用，数据挖掘研究[17]发现养阴清肺法是治疗肺癌的常用法则，且知母使用频率较高，故选择知母作为清热法的代表中药。干姜是温中散寒类中药，同样具有抗癌药理作用[10]，故选择干姜作为温阳法的代表中药。本研究发现，清热药知母与吉非替尼有协同作用，而温阳药干姜能拮抗吉非替尼的抗肿瘤作用，提示吉非替尼适合与清热类中药联用来治疗EGFR敏感突变合并PI3K/AKT通路异常活化的NSCLC 患者。有研究者发现，清热中药苦参注射液能够通过下调PI3K/AKT/mTOR 通路，上调细胞自噬对吉非替尼增敏[18]；清热中药提取物如大黄素、澳洲茄边碱、黄芩苷、紫草素等也具有抑制PI3K/AKT 磷酸化的作用[19]，进一步提示清热中药与PIK/AKT通路的关系。

AKT 是PI3K 信号传导的重要致癌效应因子，磷酸化AKT 对活性氧（ROS）的调控起双向作用，既可直接调节线粒体生物氧化和激活NADPH 氧化酶促进ROS的产生，也能调控Nrf2促进ROS的清除[20]。在肿瘤细胞中，氧化还原代谢的重编程会导致ROS 的异常积累。由于ROS 在特定亚细胞结构中的分布、浓度和持续时间不同，其在肿瘤生长、转移和凋亡中发挥不同的作用[21]。ROS 在肿瘤进展中具有双重作用，包括ROS 依赖的恶性转化和氧化应激诱导的细胞死亡[21]。在明确清热药物知母能增强PI3K 通路异常介导的EGFR-TKIs 耐药细胞对吉非替尼的敏感性之后，本研究初步探索了知母、干姜与吉非替尼联用之后对胞质ROS 和线粒体ROS 的影响。结果表明，在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 细胞中，与对照组比较，知母联合吉非替尼能促进线粒体ROS 水平升高，而干姜联合吉非替尼能抑制线粒体ROS水平升高。

综上所述，清热药知母可能通过上调线粒体ROS水平，进而促进氧化应激诱导的细胞死亡，逆转PI3K/AKT通路异常活化介导的吉非替尼耐药，而温阳药干姜可能通过下调线粒体ROS 水平而部分拮抗吉非替尼的抗肿瘤作用。提示临床对于EGFR敏感突变合并PI3K 通路异常的患者，EGFR-TKIs 应该与清热类中药联合应用，以增加EGFR-TKIs 敏感性，延缓甚至逆转耐药，从而提高患者疗效。然而知母、干姜仅仅是个别具有代表性的单味中药，其他清热类中药或复方是否也对PI3K激活介导的EGFR-TKIs耐药起到增敏甚至延缓、逆转耐药作用，需要进一步探索。