基于TNF-α/TNFRs信号探讨党参异功散防治阿尔兹海默病的作用机制

曾静，赵子瑄，花雷，阳勇，5，张小梅，5，魏江平，，李利生（1.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 56000；2.遵义医科大学贵州省基础药理重点实验室/药学院药理学教研室，贵州 遵义 56000；.重庆市中药研究院/国家中医药管理局中药化学三级实验室，重庆 00065；.重庆医科大学，重庆 00016；5.川渝共建慢病中药新药泸州市重点实验室，四川 泸州 66000）

我国已步入人口老龄化时代，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）已成为威胁老年群体健康的重大挑战。中医学认为脾胃为人体气血生化之源，为后天之本，脾胃虚弱是导致痴呆发病的重要原因。脾为生痰之源，痰浊内盛，阻塞清窍则发痴呆，著名医家陈士铎将从脾论治AD概括为“治呆无奇法，治痰即治呆”。异功散是北宋医家钱乙所创的名方，首载于《小儿药证直诀》，后被《脾胃论》收载，由人参、茯苓、白术、陈皮和甘草组成。党参异功散将异功散方中人参替换为党参而得，具有补气健脾、行气化滞的功效，擅长调理脾运。其中党参补中益气、生津；茯苓益脾和胃、宁心安神；白术为补脾胃之要药，善健脾益气、燥湿利水；陈皮理气健脾、燥湿化痰；甘草益气补中、调和诸药。上述5 味中药均是治疗AD 的常用药[1]，由四君子汤加陈皮而成方，四君子汤具有明确的抗AD 作用[2-3]，而陈皮中的川陈皮素（Nobiletin）[4]、橙皮苷（Hesperidin）[5]和橘皮素（Tangeretin）[6]等活性成分均有明显的抗AD效应。

近年来大量研究[7-10]发现，脾脏与脑通过免疫炎症机制与诸多神经系统性疾病相关联，脾-脑链接机制有助于阐释中医从脾论治AD的科学内涵。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种由多种细胞产生的跨膜蛋白，是包括大脑在内的诸多器官系统免疫应答的主要调节因子[11]。脑卒中发生时脾细胞如单核细胞及T细胞等受趋化因子信号募集迁移至脑，分泌TNF-α等炎性因子促进炎症和组织损伤[9，12]。TNF-α 与其受体（TNFRs）结合，启动细胞内信号级联，促进谷氨酸的大量释放，进一步加重神经细胞损伤或死亡[13]。本研究在预实验中通过网络药理学分析发现，党参异功散治疗AD的潜在作用机制涉及TNF靶点及其相关信号通路。D-半乳糖诱导的亚急性衰老动物表现出神经、免疫（脾脏、胸腺）等功能退化，涉及免疫炎症等机制[14]，是常用的AD动物模型[15-16]。故本研究拟以D-半乳糖诱导AD 小鼠模型，基于TNF-α/TNFRs信号探讨党参异功散抗AD的分子机制，以期为“治痰即治呆”理论提供实验依据。

1 材料

1.1 动物雄性昆明（KM）小鼠40 只，SPF 级，体质量（20±2）g，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物质量合格证号：430727220100313743。动物饲养于重庆市中药研究院实验动物研究所动物观察室，自由摄食、饮水。本动物实验经重庆市中药研究院实验动物福利伦理审查委员会审批，批文号：YHS2022-04。

1.2 药物及制备党参（批号：200701）、茯苓（批号：211201）、白术（批号：200401）、陈皮（批号：211101）和甘草（批号：201201），均购自重庆华奥药业有限公司，上述药材均由重庆市中药研究院中药生药研究所瞿显友研究员鉴定为正品。取上述5味中药饮片各50 g，依次加8、6、4 倍量水，加热提取3 次，每次0.5 h；滤过，合并滤液，浓缩至300 mL（0.8 g·mL-1），冷藏备用。

1.3 试剂D-半乳糖（批号：21161745），合肥兰杰柯科技公司；盐酸多奈派齐片（安理申，批号：2105147），卫材（中国）药业有限公司；离子钙结合适配器分子1（IBA1）抗体（批号：ab178846）、胶质纤维状酸性蛋白（GFAP）抗体（批号：ab7260）、突触素（Synaptophysin）抗体（批号：ab32127），均购自美国Abcam公司；DAPI（批号：G1012）和抗荧光淬灭封片剂（批号：G1401），均购自武汉赛维尔公司。肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）抗体（批号：T55380M）、肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）抗体（批号：TA0282M）、转化生长因子α（TGF-α）ELISA 试剂盒（批号：ABJ0400A）、TGF-β ELISA试剂盒（批号：AB-J0401A），均购自艾比玛特生物医药（上海）公司；TNF-α ELISA试剂盒（批号：EK282/4-96）、白细胞介素10（IL-10）ELISA试剂盒（批号：EK210/4-96），均购自杭州联科生物技术股份有限公司；谷氨酸测试盒（批号：20220715），南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器MP30KC 型电子天平，上海舜字恒平科学仪器有限公司；BSA224S型电子天平（万分之一），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Morris水迷宫分析系统，荷兰Noldus公司；JB-P5型包埋机，武汉俊杰电子有限公司；RM2016型病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；E100 型显微镜、DS-U3 成像系统，日本尼康公司；荧光正置显微镜，日本Olympus 公司；Read Max 1200型光吸收全波长酶标仪，上海闪谱生物科技公司；WD-9423BC 型化学发光成像系统，北京六一生物科技公司；Power Pac 基础电泳仪，美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 党参异功散治疗AD 的网络药理学分析通过TCMSP 数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分别检索党参异功散中所包含的5 味中药的化学成分，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Druglikeness，DL）≥0.18为条件，筛选活性成分及其作用靶点，剔除无对应靶点的成分。在BATMAN-TCM 数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中继续分别检索党参异功散中所包含的5 味中药的作用靶点，将有关参数设定为Score cutoff＞100、AdjustedP-value≥0.05，并将所得靶点与TCMSP 数据库得到的靶点进行比较，去除重复靶点。在DisGeNET平台（https：//www.disgenet.org）中检索AD疾病相关靶点（EI=1），然后获取党参异功散成分作用靶点和AD 疾病相关靶点的交集（共同靶点），即为党参异功散治疗AD 的潜在作用靶点。运用STRING 数据库（https：//cn.string-db.org）对潜在作用靶点进行蛋白互作（PPI）网络分析，然后通过Cytoscape软件的CentiScaPe插件分析出关键靶点，并对其进行KEGG通路富集分析。

2.2 分组、模型复制及给药[17]将小鼠适应性喂养后进行学习记忆能力评价（Morris水迷宫实验），然后根据各小鼠的学习记忆能力结合体质量随机分为空白组、模型组、安理申组（1.5 mg·kg-1）及党参异功散高（7.5 g·kg-1）、低（3.75 g·kg-1）剂量组，每组8 只。除空白组外，其余各组小鼠颈背部皮下注射200 mg·kg-1D-半乳糖复制AD 小鼠模型，每天1 次，连续30 d，空白组小鼠在相同部位注射等体积生理盐水。同时给药组每天以相应剂量药物灌胃（10 mL·kg-1），空白组及模型组灌胃等体积纯水，每天1 次，连续30 d。根据《中华人民共和国药典》中的规定剂量结合异功散处方中各药物等分配比，确定临床用量为每日45 g，以人用剂量的10 倍为小鼠等效剂量，折算党参异功散高、低剂量为7.5、3.75 g·kg-1。

2.3 Morris 水迷宫实验给药第26 天至第30 天进行Morris水迷宫实验，检测小鼠学习记忆能力。定向航行试验中将所有小鼠分别从面朝池壁的同一定点依次放入池中，记录2 min内小鼠找到隐藏平台的时间即为逃避潜伏期；若未找到平台则引导小鼠至平台上并停留10 s。第5天进行空间探索试验，记录各组小鼠在平台象限的停留时间、穿越平台象限次数。

2.4 小鼠海马组织病理形态学观察完成末次Morris水迷宫实验后，麻醉后处死小鼠，冰上取脑组织。将小鼠海马及皮层组织于4%多聚甲醛溶液中固定后，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后进行石蜡切片（5 μm）；选取海马及皮层组织各区域完整的切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，进行常规苏木素-伊红（HE）染色；透明、封片后，在显微镜下观察海马细胞的病理形态变化，并进行海马受损神经细胞病理评分[18]。

2.5 免疫荧光法检测小鼠海马组织GFAP、IBA1 及Synaptophysin 的表达将用4%多聚甲醛溶液固定后的海马组织脱水、包埋后，切成5 μm 薄片，以5% Triton-X-100 通透后滴加10%山羊血清封闭液进行封闭；然后滴加IBA1、GFAP、Synaptophysin 抗体，4 ℃下过夜；PBS 清洗后，滴加荧光二抗后在37 ℃下孵育1 h；避光条件下滴加含DAPI 的抗荧光衰减封片剂封片；在荧光显微镜下观察并拍照，采用ImageJ 图像分析系统测定阳性表达面积比，作为蛋白表达水平。

2.6 ELISA 法测定小鼠海马及皮层组织中谷氨酸、TNF-α、IL-10、TGF-α、TGF-β 水平根据各试剂盒样本制备要求制备脑组织样本匀浆液，然后严格按照各试剂盒说明书步骤操作，分别检测各组小鼠海马及皮层组织中的谷氨酸、TNF-α、IL-10、TGF-α、TGF-β含量。

2.7 Western Blot 法检测小鼠海马及皮层组织中TNFR1、TNFR2 蛋白表达水平取小鼠海马及皮层组织，称定质量后，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液（含有1%磷酸酶抑制剂∶1% PMSF），匀浆后以4 ℃、12 000 r·min-1（离心半径=5 cm）离心10 min，采用BCA 法测定上清液蛋白浓度。加上样缓冲液和RIPA 制备样品，蛋白经SDS-PAGE 电泳后，转移至PVDF 膜上；用5%脱脂奶粉封闭1.5 h 后，加入一抗［TNFR1（1∶1 000）、TNFR2（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）］孵育过夜；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶4 000），室温下孵育1.5 h；使用超敏增强型化学发光试剂（ECL）显影并扫描，采用Quantity One 软件分析计算蛋白条带灰度值，并进行半定量分析。

2.8 统计学处理方法采用GraphPad Prism 9 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用Tukey’s 检验，不符合正态分布则采用非参数检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 党参异功散治疗AD 的网络药理学分析结果通过网络药理学分析获得党参异功散的活性成分112 个，作用靶点375个，AD疾病相关靶点3 053个，党参异功散治疗AD 的潜在作用靶点187 个。潜在作用靶点PPI 网络分析后通过Cytoscape 软件的CentiScaPe 插件分析出关键靶点38 个。对关键靶点进行KEGG 通路富集分析，得到107 条与AD 疾病相关的信号通路，包括神经TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等，结果见图1、表1。

表1 党参异功散治疗阿尔兹海默病关键靶点的KEGG 通路富集分析Table 1 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Dangshen Yigong San in the treatment of Alzheimer’s disease

图1 党参异功散治疗阿尔兹海默病关键靶点的KEGG 通路富集分析Figure 1 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Dangshen Yigong San in the treatment of Alzheimer’s disease

3.2 党参异功散对AD 小鼠学习记忆能力的影响结果见图2。与空白组比较，模型组小鼠的第5 天逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），穿越平台象限次数及停留时间明显减少（P＜0.05）。与模型组比较，党参异功散高剂量组小鼠第5天的逃避潜伏期显著缩短（P＜0.01），高、低剂量组小鼠穿越平台象限次数及停留时间明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 党参异功散对阿尔兹海默病小鼠学习记忆能力的影响（±s，n=8）Figure 2 Effect of Dangshen Yigong San on learning and memory ability of Alzheimer’s disease mice（±s，n=8）

3.3 党参异功散对AD 小鼠海马组织病理变化的影响结果见图3。与空白组比较，模型组小鼠海马神经细胞排列紊乱（红色箭头），部分细胞缺失，细胞间隙变大（蓝色箭头），并可见细胞核固缩、变性或死亡（黄色箭头），病理评分显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，党参异功散高、低剂量组小鼠海马神经细胞排列相对整齐、紧密，结构清晰，偶见个别神经细胞变性或死亡，病理评分明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 党参异功散对阿尔兹海默病小鼠海马组织病理变化的影响（HE 染色；±s，n=8）Figure 3 Effect of Dangshen Yigong San on pathological changes of hippocampal tissue in Alzheimer’s disease mice（HE staining；±s，n=8）

3.4 党参异功散配伍对AD 小鼠海马组织GFAP、IBA1、Synaptophysin 表达的影响结果见图4。与空白组比较，模型组小鼠海马组织的GFAP、IBA1阳性表达面积比显著升高（P＜0.01），Synaptophysin 阳性表达面积比显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，党参异功散高、低剂量组小鼠海马组织的GFAP、IBA1 阳性表达面积比显著降低（P＜0.05，P＜0.01），Synaptophysin 阳性表达面积比显著升高（P＜0.01）。

3.5 党参异功散对AD 小鼠脑组织中谷氨酸、TNF-α、IL-10、TGF-α、TGF-β 水平的影响结果见图5。与空白组比较，模型组小鼠脑组织中谷氨酸、TNF-α、TGF-α、TGF-β 含量均显著升高（P＜0.01），IL-10 含量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，党参异功散高、低剂量组小鼠脑组织中谷氨酸、TNF-α、TGF-α 含量均显著降低（P＜0.01），IL-10含量显著升高（P＜0.01）；党参异功散低剂量组小鼠脑组织中TGF-β含量显著降低（P＜0.01）。

3.6 党参异功散对AD 小鼠脑组织TNFR1、TNFR2蛋白表达的影响结果见图6。与空白组比较，模型组小鼠脑组织TNFR1 蛋白表达明显上调（P＜0.05），TNFR2 蛋白表达显著下调（P＜0.01）。与模型组比较，党参异功散高剂量组小鼠脑组织TNFR1 蛋白表达明显下调（P＜0.05），TNFR2 蛋白表达明显上调（P＜0.05）。

图6 党参异功散对阿尔兹海默病小鼠脑组织TNFR1、TNFR2 蛋白表达的影响（±s，n=8）Figure 6 Effect of Dangshen Yigong San on TNFR1 and TNFR2 protein expressions in brain tissue of Alzheimer’s disease mice（±s，n=8）

4 讨论

阿尔茨海默病（AD）属中医学“痴呆”“呆病”范畴，病机为本虚标实，本虚为肾精亏损和气血不足，标实为痰浊阻窍、气滞血瘀，虚、痰、瘀互结并贯穿疾病始终[18-19]。脾为气血生化之源、后天之本，脾虚则运化水谷精微不力，导致气血乏源、精气生化不足无以充脑填髓；再者脾运化失常，聚湿生痰，痰瘀互结，久酿成毒，蒙蔽清窍，故脾在AD疾病过程中具有重要意义。临床上常用茯苓健脾除湿，甘草温运脾胃，人参或党参补脾生津，白术健脾燥湿，陈皮理气化痰，均是治疗AD 的常用中药[20-22]。党参、人参均为补气要药，常用于补气健脾以治脾胃虚弱，人参大补元气为峻烈之剂，党参与人参功效相似为平补和缓之剂，临床上两者常作替换[23]。本研究结果表明，党参异功散能够明显提高D-半乳糖诱导AD小鼠的学习记忆能力，改善其海马神经细胞的病理损伤。

研究发现，D-半乳糖可能引起小胶质细胞过度激活，并通过释放促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α[24]来诱导神经炎症反应，而机体产生TGF-α 、TGF-β[25]及IL-10 等抗炎细胞因子可能通过调节IL-1β、IL-6的产生来减轻神经炎症[26]。本研究发现，模型组小鼠海马区GFAP、IBA1 阳性表达明显上调，脑组织中TNF-α、TGF-α及TGF-β含量明显升高，IL-10水平明显降低，说明AD模型小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化并出现神经炎症反应，与相关研究报道一致。而党参异功散干预后，AD 小鼠海马组织的GFAP、IBA1阳性表达显著下调，TNF-α、TGF-α及TGF-β含量明显降低，IL-10含量显著升高。

TNFR1、TNFR2 均是TNF-α 受体，TNFR1 几乎表达于所有有核细胞表面，而TNFR2 则诱导性表达于一些免疫细胞、神经细胞和内皮细胞。TNF-α 与TNFR1、TNFR2结合可产生相反的生理效应[27]，如可溶性TNF-α 与TNFR1 结合介导有害促炎效应及细胞死亡，而跨膜型TNF-α 与TNFR2 结合通过少突胶质细胞、小胶质细胞和可能的其他细胞类型介导有益效应及细胞存活[28]。研究[29]发现，小胶质细胞可通过位于其表面的趋化因子受体4（CXCR4）过度激活而产生TNF-α，TNF-α 则可进一步与位于星形胶质细胞上的TNFR1 结合而促进谷氨酸的释放；星形胶质细胞也可以通过表面的CXCR4 激活而引起细胞内钙离子浓度上升，并促进胞内可溶性TNF-α 及谷氨酸释放，最终导致谷氨酸过度释放而引起神经细胞毒性[29]。本研究虽没有区分可溶性TNF-α 和跨膜型TNF-α 的水平，但从空白组和模型组小鼠脑组织中TNF-α、谷氨酸含量以及TNFRs 表达水平变化可以看出TNF-α/TNFRs信号参与了AD模型小鼠脑内的神经炎症反应。而党参异功散干预后，能够明显降低AD 小鼠脑内的促炎症因子及谷氨酸水平，并能够下调TNFR1蛋白表达，促进TNFR2蛋白表达。

综上所述，党参异功散能够提高D-半乳糖诱导AD 小鼠的学习记忆能力，并改善海马组织病理损伤，其作用机制可能与调控脑内TNF-α/TNFRs 信号减轻神经炎症反应有关。