南蛇藤提取物通过抑制有氧糖酵解对大鼠胃癌前病变的影响

张效泽，朱方圆，刘延庆，朱耀东（.安徽医科大学第一附属医院，安徽 合肥 30000；.扬州大学，江苏 扬州 5000）

胃癌前病变（Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）是一个病理性概念，是指较易转变为胃癌组织的病理学变化，包括肠上皮化生和异型增生，主要伴存于慢性萎缩性胃炎，是从正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段[1]。胃癌前病变具有双向转化的特点，早期干预和治疗能有效逆转胃黏膜上皮细胞向恶性发展并预防胃癌的发生，现已成为胃癌二级预防的重点研究方向[2]。

现代医学对胃癌前病变尚缺乏疗效肯定的治疗药物和方法，而中医药在逆转胃癌前病变等方面则显示出自己独特的优势。目前对中医药逆转胃癌前病变的研究，已形成了基于循证医学证据的作用机制探索。一些学者[3-4]运用网络药理学对中医经典名方如四君子汤、半夏泻心汤治疗胃癌前病变的活性成分、药物作用靶点及作用通路进行分析，为阐释中医药逆转胃癌前病变的作用机制提供了研究参考。然而由于中药复方成分的多样性，以及其与机体相互作用的复杂性，导致其分子机制的揭示一直十分困难。

南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb），辛温、有小毒，归肝、膀胱经，具有解毒消肿、祛风除湿、活血通经等功效，主要用于治疗筋骨疼痛、腰腿痛、风湿性关节炎、闭经、痢疾、跌打损伤、疮疡痈肿等病症[5]。前期研究[6]发现南蛇藤提取物（Celastrusorbiculatusextract，COE）可以逆转胃癌前病变过程，但其具体机制尚不清楚。研究[7]表明，上调的有氧糖酵解代谢通路是胃癌前病变为适应缺氧微环境而进行细胞选择的结果，在此过程中FOXO4发挥了关键作用。因此，本研究拟从有氧糖酵解及FOXO4 的角度，探讨南蛇藤提取物逆转大鼠胃癌前病变的分子药理机制，对胃癌早期预防具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 动物SD大鼠70只，雄性，SPF级，8周龄，体质量（115±15）g，安徽医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（皖）2017-001，动物质量合格证号：340729220100026214，饲养于安徽医科大学实验动物中心，饲养条件：（23±2）℃、相对湿度（55±5）%、12 h/12 h 光照黑暗循环，自由饮水进食。本实验经安徽医科大学动物伦理委员会批准，批准号：LLSC20220294。

1.2 药物及试剂南蛇藤饮片购自广州致信药业有限公司，批号：070510。Trizol试剂盒，美国Solarbio公司，批号：R1100；逆转录试剂盒，北京宝日生物有限公司，批号：RR036A；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）试剂盒，美国Promega公司，批号：A6001；甲基硝基亚硝基胍N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG），日本东京Kabushiki 株式会社，批号：ZG4T1-FP；苏木素染色液，武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1004；伊红染液，国药集团化学试剂有限公司，批号：71014544；乳酸试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：mLsh0715；HK2、 PKM2、 FOXO4 一抗，美国Thermo Fisher 公司，批号分别为：PA5-29326、PA5-28700、MA5-32385；LDHA 一抗，美国Cell Signaling Technology 公司，批号：3582S；GLUT1 一抗，美国Santa 公司，批号：sc-377228；HIF-1α 一抗，美国CST 公司，批号：36169；二抗山羊抗兔，美国ImmunoWay 公司，批号：RS0002。引物通过Primer Premier 5.0软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 主要仪器TS100 倒置显微镜，日本Nikon 公司；CFX96 型Touch PCR 仪，美国BioRad 公司；KZ-Ⅱ型号匀浆仪，武汉Servicebio公司。

1.4 药物制备南蛇藤提取物的提取制备流程已获批国家专利[8]。主要流程为：将南蛇藤饮片打碎成粉，用浓度为95%的乙醇加热回流提取3 次，回收溶剂，浓缩至干。将干燥的粉末加水分散，用石油醚和醋酸乙酯分别萃取3 次，回收溶剂，减压浓缩，真空冻干。

1.5 分组、模型复制及给药方法所有大鼠适应性喂养7 d。采用复合模型复制法[9]构建大鼠胃癌前病变模型：将70 只大鼠随机分为正常组（15 只）与胃癌前病变组（55只）；胃癌前病变组大鼠自由饮用170 μg·mL-1的MNNG 溶液，同时用含有0.03%盐酸雷尼替丁的SPF大鼠饲料喂养，喂食2 d，禁食1 d，空腹当天下午使用2%水杨酸钠溶液10 mL·kg-1进行灌胃。第12 周末，分别从两组大鼠中随机选取5只处死，取胃黏膜组织，HE染色鉴定模型是否制备成功。以胃黏膜腺体结构紊乱，腺体萎缩且数目减少，上皮细胞核深染增大，极性减弱，有丝分裂增加，胞浆比增加为模型复制成功标准。将胃癌前病变模型制备成功后的大鼠，随机分为模型组（170 μg·mL-1）与南蛇藤提取物低、中、高剂量组（12.5、25、50 mg·kg-1），每组10 只，南蛇藤提取物灌胃给药4 周，每日1 次；另设正常组予以等量的生理盐水灌胃。

1.6 标本采集给药结束后，禁食12 h，不禁水，使用3%戊巴比妥钠，以150 mg·kg-1剂量腹腔注射麻醉处死大鼠，迅速解剖获取胃体-胃窦交界处胃黏膜，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h。

1.7 HE 染色法观察病理形态学变化胃黏膜组织进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋处理。切取厚度为5～6 μm 石蜡切片，HE 染色，光镜（×200）下观察胃黏膜组织病理学改变。

1.8 化学比色法检测乳酸含量使用化学比色法检测胃黏膜组织乳酸含量。胃黏膜组织按照质量（g）∶提取液体积（mL）为1∶5 的比例加入提取液，冰浴机械匀浆后，置入离心机4 ℃、3 000 r·min-1（离心半径8.5 cm）离心10 min。取上清液与检测试剂充分混匀，于37 ℃反应30 min。置于1 mL 玻璃比色皿内，蒸馏水调零，测定530 nm 处吸光度值。具体的操作流程按试剂盒说明书进行。

1.9 免疫组化检测胃黏膜组织中蛋白表达情况取大鼠胃黏膜组织用石蜡包埋并切片，脱蜡后进行抗原修复，使用3%H2O2室温孵育切片10 min，PBS 冲洗3 次，每次5 min。室温下使用山羊血清封闭切片孵育20 min，滴加提前配置好的一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次5 min。滴加二抗并在室温条件下孵育1 h，滴加DAB溶液进行染色，苏木素复染40 min，脱水，封片。使用显微镜200倍视野下观察拍照，以棕黄色颗粒表示阳性表达。随机选取最具代表性的1个视野进行观察。

1.10 实时荧光定量PCR 法检测胃黏膜组织中mRNA表达情况取100 mg 组织加入匀浆管中，滴加1 mL的Trizol Reagent，用匀浆仪将组织充分研磨。依据RNA提取试剂盒流程提取总RNA，检测总RNA 纯度与浓度。随后依据逆转录试剂盒流程将RNA 逆转录为cDNA，简述为25 ℃条件下退火5 min，42 ℃条件下延伸1 h，70 ℃条件下15 min，使逆转录酶失活。依据试剂盒流程进行PCR 扩增，简述为95 ℃条件下预变性10 min，95 ℃条件下变性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃条件下延伸15 s，循环40 次，在60～95 ℃生成溶解曲线。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法进行计算，使用GraphPad Prism 8.4.0 进行统计绘图。Real-time PCR引物序列见表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of Real-time PCR

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，结果以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVO）。两组间的比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠胃黏膜形态的影响结果见图1。正常组胃黏膜皱襞光滑，表面黏液附着，无糜烂与出血点，胃壁厚度一致。模型组的胃黏膜皱襞粗糙且欠光滑，光泽度差，可见散在出血点，表面黏液附着量减少，胃壁厚度不一。与模型组比较，南蛇藤提取物低、中、高剂量组中，胃黏膜可见胃黏膜皱襞变光滑、出血点减少、光泽度变清晰等不同程度的好转。

图1 南蛇藤提取物（COE）对胃癌前病变（PLGC）大鼠胃黏膜形态的影响Figure 1 Effect of Celastrus orbiculatus extract（COE）on gastric mucosa morphology in rats with precancerous lesions of grastic cancer（PLGC）

2.2 南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠胃黏膜病理变化的影响结果见图2。正常组胃黏膜上皮细胞排列整齐，腺体结构完整，形状规则，边界清晰，细胞核大小均一且呈椭圆形，核仁明显，核浆比正常；模型组胃黏膜腺体结构、排列紊乱，边界欠清晰，腺体萎缩且数目减少，上皮细胞大小不一，可见核深染、增大，核浆比增加，细胞核极性明显减弱且核分裂增加；南蛇藤提取物低、中、高剂量组中，胃黏膜病变分别可见不同程度的好转。

图2 南蛇藤提取物（COE）对胃癌前病变（PLGC）大鼠胃黏膜病理变化的影响（HE 染色，×200）Figure 2 Effect of Celastrus orbiculatus extract（COE）on pathological changes of gastric mucosa in precancerous lesions of grastic cancer（PLGC）rats（HE staining，×200）

2.3 南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠胃黏膜乳酸含量的影响结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜的乳酸含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，南蛇藤提取物低、中、高剂量组大鼠胃黏膜的乳酸含量均明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。以上结果表明南蛇藤提取物能够降低模型组胃黏膜乳酸含量。

表2 南蛇藤提取物（COE）对胃癌前病变（PLGC）大鼠胃黏膜乳酸含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Celastrus orbiculatus extract（COE）on lactic acid content of gastric mucosa in precancerous lesions of grastic cancer（PLGC）rats（±s，n=10）

表2 南蛇藤提取物（COE）对胃癌前病变（PLGC）大鼠胃黏膜乳酸含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Celastrus orbiculatus extract（COE）on lactic acid content of gastric mucosa in precancerous lesions of grastic cancer（PLGC）rats（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

乳酸含量/（mmol·g-1）0.274±0.005 0.520±0.006**0.390±0.006##0.326±0.006##0.282±0.003##组别正常组模型组南蛇藤提取物低剂量组南蛇藤提取物中剂量组南蛇藤提取物高剂量组剂量/（mg·kg-1）--12.5 25 50

2.4 南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠胃黏膜中HK2、PKM2、GLUT1、LDHA、HIF-1α 和FOXO4 蛋白表达的影响结果见图3。免疫组化染色结果表明，HK2主要表达于线粒体与细胞质中，PKM2主要表达于细胞核与细胞质中，GLUT1 主要表达于细胞膜中，LDHA 主要表达于细胞质中，HIF-1α 主要表达于胃黏膜细胞的细胞质与细胞核中。与正常组比较，模型组大鼠可见HK2、PKM2、LDHA、GLUT1、HIF-1α 阳性染色颗粒明显增多且染色较深，分布密集；南蛇藤提取物低、中、高剂量组与模型组比较，可见阳性染色颗粒明显减少，染色变浅。FOXO4 主要表达于胃黏膜细胞的细胞质与细胞核中，与正常组比较，模型组可见FOXO4 阳性染色颗粒明显减少，染色较浅；南蛇藤提取物低、中、高剂量组与模型组比较，可见FOXO4 阳性染色颗粒增加，染色较深。

2.5 南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠胃黏膜中HK2、PKM2、GLUT1、LDHA、HIF-1α 和FOXO4mRNA水平的影响结果见图4。与正常组比较，模型组有氧糖酵解标志物HK2、PKM2、LDHA、GLUT1、HIF-1α 的mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），FOXO4 的mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，南蛇藤提取物低、中、高剂量组中有氧糖酵解标志物HK2、PKM2、LDHA、GLUT1、HIF-1α的mRNA 水平明均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），FOXO4的mRNA表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 南蛇藤提取物（COE）对胃癌前病变（PLGC）大鼠胃黏膜HK2、PKM2、GLUT1、LDHA、HIF-1α 和FOXO4 mRNA 表达的影响Figure 4 Effect of Celastrus orbiculatus extract（COE）on mRNA expressions of HK2，PKM2，GLUT1，LDHA，HIF-1α and FOXO4 in of gastric mucosa in precancerous lesions of grastic cancer（PLGC）rats

3 讨论

肿瘤酸性微环境作为所有实体瘤共同的理化性质，在肿瘤进展中扮演着重要角色[10]。研究[11]表明，正常细胞与肿瘤细胞在葡萄糖代谢方面存在明显差异，即肿瘤细胞在氧气充足的条件下，也会消耗较多葡萄糖并产生大量乳酸的情况，这一过程也被称为“Warburg 效应”，而乳酸的过量和持续生成导致酸性肿瘤微环境的生成。肿瘤微环境中的乳酸浓度可高达10～30 mmol·L-1，而其在正常生理条件下的浓度约为1.5～3.0 mmol·L-1[12]。肿瘤酸性微环境可通过增强肿瘤细胞恶性、促进肿瘤细胞外基质降解和血管新生，明显促进肿瘤侵袭和转移[13]。因此，纠正肿瘤的酸性微环境的状态，破坏肿瘤细胞的生存环境是预防肿瘤发生的关键所在。

酸性微环境广泛存在于肿瘤发生发展进程中，其形成与肿瘤细胞特有的代谢方式有氧糖酵解密切相关。有氧糖酵解过程中的糖酵解中间体可用于合成核苷酸、氨基酸和脂类，同时产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），满足肿瘤和增殖细胞对大分子合成及能量的需求[14]。其中PKM2是有氧糖酵解过程中的关键限速酶；LDHA 是关键的底物调节酶，其过度活跃可明显驱动有氧糖酵解过程；HIF-1α 通过激活糖酵解基因的转录促进有氧糖酵解过程，在Warburg 效应中处于中心位置[15]。据报道[16]，在癌细胞HIF-1α/ALYREF/PKM2 通路中，HIF-1α 能够激活ALYREF 间接上调PKM2 的表达，同时促进癌细胞有氧糖酵解，表明二者在有氧糖酵解中具有调控作用。研究[17]证实，抑制HIF-1α 及其下游靶点LDHA的表达会导致有氧糖酵解的减少和氧化磷酸化的增加，HIF-1α -LDHA表达的上调能够促进有氧糖酵解。这说明三者在有氧糖酵解中发挥了关键作用。同时有研究[18]发现，抑制有氧糖酵解过程能够明显提高胃癌细胞中上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达，降低间充质标志物如N-钙黏蛋白（N-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达，从而抑制癌症的转移与发展。课题组前期研究[19]已经证实，南蛇藤提取物能够通过促进E-Cadherin、抑制NCadherin 和Vimentin 的蛋白及mRNA 表达，抑制甚至逆转胃癌前病变，发挥抗癌作用。在本研究中，我们也发现南蛇藤提取物能够缓解胃癌前病变大鼠胃黏膜的病变；降低大鼠胃黏膜的乳酸含量；降低有氧糖酵解标志物HK2、PKM2、GLUT1、LDHA、HIF-1α 蛋白及mRNA的表达，这与课题组前期研究结论相符合。由此我们认为南蛇藤提取物能够逆转胃癌前病变，预防胃癌的发生，其机制可能与抑制有氧糖酵解有关。

FOXO 蛋白是在DNA 结合域具有高度保守的翼状、螺旋结构的一类转录调控因子，家族成员包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6，参与调节各种细胞进程，包括细胞周期、细胞凋亡、DNA 损伤修复、应激反应以及代谢等过程[20]。最新研究[21]表明，在胃癌中FOXO4 通常处于被下调的状态。恢复胃癌细胞中FOXO4 的表达可以明显降低胃癌细胞的有氧糖酵解率，而沉默FOXO4 的表达可以促进胃癌细胞的有氧糖酵解率[22]。同时，FOXO4与LDHA的通路具有一定关联性，FOXO4 可以与LDHA 的启动子结合，并以剂量依赖性的模式抑制LDHA 的活性，而LDHA的表达下调能够缓解胃癌前病变中的异常糖酵解[6]。基于此，我们认为促进FOXO4 表达在抑制胃癌，调节有氧糖酵解中发挥关键作用，可以作为防治胃癌的新策略。本研究中，我们发现南蛇藤提取物能够提高胃黏膜细胞中FOXO4 的蛋白及mRNA 表达，由此我们推测，FOXO4 可能是南蛇藤提取物逆转胃癌前病变，抑制有氧糖酵解逆转胃癌前病变的关键靶点。

课题组前期研究[23]发现，南蛇藤提取物在调控E-Cadherin、N-Cadherin 和Vimentin 的蛋白及mRNA表达的同时，也能降低富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（leucine-rich repeat containing G proteincoupled receptor，Lgr5）的表达。提高FOXO4 表达能够降低E-Cadherin 表达，促进Vimentin 表达；沉默FOXO4 则会抑制N-Cadherin 表达，这为阐明FOXO4调控有氧糖酵解，抑制胃癌发生发展的理论机制提供了有力支撑[24-25]。实验[26-27]证实，Lgr5+细胞通常分布在胃窦部，并且能够自我更新并分化为胃窦上皮的所有细胞类型，且Lgr5 在胃癌细胞中的表达明显增加。因此，胃Lgr5+干细胞通常被认为是研究胃癌前病变及胃癌发生的干细胞群。值得注意的是，上皮细胞极性丧失，E-Cadherin表达减少，N-Cadherin和Vimentin 表达增加是上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）的典型特点[28]。而EMT也被认为是癌症患者的主要死亡原因——癌细胞转移的关键影响因素之一[29]。这进一步佐证了本研究与前期工作的一致性与科学性。

本研究作为课题组前期工作的深入研究，重点着眼于胃癌前病变与有氧糖酵解，在课题组前期工作的基础上，我们通过检测有氧糖酵解相关标志物与信号通路的表达情况，探讨南蛇藤提取物对胃癌前病变大鼠有氧糖酵解的影响。本研究结果验证了南蛇藤提取物逆转胃癌前病变的作用，这与我们前期已发表结果相符合。

综上所述，我们认为南蛇藤提取物能够有效逆转大鼠胃癌前病变的发生，纠正大鼠胃黏膜的酸性微环境，其机制可能与抑制有氧糖酵解、上调FOXO4的表达有关。下一步，本课题组将对南蛇藤提取物抑制有氧糖酵解的具体机制进行深入探讨。本研究为临床治疗胃癌前病变提供了思路，也为将来的研究工作提供了良好的基础。