卡痛叶中生物碱类活性成分研究进展

李玉静，何洪源*，李润康，赵 霞

（1.中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；2.中国民用航空中南地区管理局公安局，广东 广州 510545；3.国家毒品实验室北京分中心，北京 100164）

卡痛树是原产于东南亚的茜草科热带植物［1］，马来西亚和泰国称之为kratom、biak-biak或ketum［2］，美国称之为mitragyna speciosa。卡痛叶属于植物类天然毒品，含有数十种吲哚类和羟吲哚类生物碱，具有兴奋和镇痛效果，长期摄入可使人产生严重依赖。早期东南亚的体力劳动者通过咀嚼新鲜的卡痛叶或饮用卡痛茶来缓解疲劳和提高体力。卡痛叶的提取物可治疗腹泻、疼痛、咳嗽和发烧［3-4］，也用于抑制阿片类毒品戒断症状或作为鸦片的替代品［5］。有些罹患精神障碍和慢性疼痛的人将卡痛制品替代处方药，用于“自我治疗”［6］。近年来，卡痛制品逐渐在欧美地区兴起［7］，多为卡痛叶的浓缩提取物，是年轻人群体中较为流行的新精神活性物质［8］。随着全球范围内卡痛叶或卡痛制品滥用人数的急剧增加，因此而导致的中毒或死亡案件时有发生［7，9-10］，许多国家已将卡痛叶列为非法物质。

在Web of Science 核心合集中，将“mitragyna speciosa”或“kratom”或“mitragynine”作为主题词，以“article”和“review”作为目标文献类型进行检索，整理得到607 篇相关文献。使用可视化分析工具CiteSpace 6.1.R6结合Excel对卡痛叶研究现状进行分析。如图1A所示，卡痛叶相关文献的年度发文量总体呈上升趋势，其中，2018年到2022年该领域发展迅速，文献发文量急剧增加，卡痛叶相关研究越来越受到关注。运用CiteSpace 进行关键词共现分析（图1B），频次较高的关键词有“alkaloid”“pharmacology”“abuse”“opioid receptor”，表明卡痛叶生物碱性质与药物滥用是该领域的研究热点问题。鉴于此，本文综述了卡痛叶生物碱类活性成分的药理毒理作用、体内代谢过程及检验方法的最新研究进展，以为卡痛叶生物碱类活性成分的准确鉴定提供技术参考。

图1 卡痛叶研究的年度发文量趋势图（A）和关键词共现图（B）Fig.1 Annual publication trend chart（A） and visualization of co-occurrence keywords（B） of the kratom study

1 卡痛叶中的生物碱类活性成分

帽柱木碱（Mitragynine）和7-羟基帽柱木碱（7-Hydroxymitragynine）是卡痛叶的主要生物碱类活性成分。Mitragynine 是卡痛叶的主要生物碱，约占卡痛叶总生物碱含量的66%（质量分数），由Ellen field 在1921 年首次分离，是具有单萜结构的吲哚类生物碱［8］，mitragynine 的非对映异构体有speciogynine、speciociliatine、mitraciliatine，其在C3、C15、C20 上的空间排列不同。受种植季节、光照强度、相对湿度、土壤类型等环境因素［11］的影响，不同产地卡痛叶中mitragynine 的含量不同，东南亚地区的mitragynine含量往往更高［12］。7-Hydroxymitragynine是卡痛叶的次要生物碱，仅占总生物碱含量的2%（质量分数），但其突出的药理学表现使之被广泛关注。7-Hydroxymitragynine 是mitragynine 在C7 位上的氧化衍生物，可由mitragynine代谢产生。

卡痛叶中还存在speciogynine、speciociliatine、paynantheine 等50 余种生物碱，相关活性有待进一步研究，其中的常见生物碱结构如图2所示。

图2 卡痛叶中的常见生物碱结构式图Fig.2 Structure diagrams of alkaloids in kratom

2 卡痛叶中生物碱类活性成分的药理、毒理作用及体内代谢过程

2.1 药理作用

卡痛叶中生物碱类活性成分的药理作用主要包括抗炎作用、抗抑郁作用和胃肠道作用。

Utar等［13］在研究mitragynine 抗炎作用时发现，低浓度时，mitragynine 抑制环氧化酶COX-2的表达，对环氧化酶COX-1无影响；高浓度时，mitragynine能够同时抑制COX-1和COX-2的表达，减少炎症介质前列腺素E2的形成，从而发挥mitragynine的抗炎作用。Shaik等［14］研究认为mitragynine的抗炎作用通过抑制促炎介质释放和改善血管通透性共同实现。

Mitragynine 也具有抗抑郁作用。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴系统功能障碍或亢进是确诊抑郁的重要指标，人类表现为皮质醇分泌多，啮齿动物表现为皮质酮分泌多［15］。Idayu等［16］在小鼠强迫游泳试验（FST）和悬尾试验（TST）中发现，mitragynine 可以显著缩短小鼠的静止时间，减少小鼠体内的皮质酮分泌，这表明mitragynine的抗抑郁功能是通过与HPA轴系统的相互作用实现的。

在对mitragynine 的胃肠道作用研究中，Matsumoto 等［17］发现mitragynine 和7-hydroxymitragynine 能够抑制小鼠的胃肠道运转。Tsuchiya等［18］将mitragynine注射到大鼠的第四脑室，发现mitragynine可以通过阿片受体作用于中枢神经系统，从而抑制胃酸分泌。Chittrakarn 等［19］发现卡痛叶提取物对蓖麻油引起的大鼠腹泻具有缓解作用。糖尿病患者血糖波动过大可直接损害胃肠道功能，Purintrapiban 等［20］在研究卡痛叶对肌肉细胞的葡萄糖转运作用时，发现卡痛叶可显著提高葡萄糖摄取率以及葡萄糖转运蛋白质水平，具有抗糖尿病作用。

2.2 毒理作用

卡痛叶中的生物碱类活性成分有两种作用机制，一是Mitragynine 与μ-阿片受体（MOR）和δ-阿片受体（DOR）相结合，7-hydroxymitragynine 与MOR 和κ-阿片受体（KOR）相结合，从而产生镇痛作用［7］；二是mitragynine阻断神经元上钙离子的反向通道，抑制神经递质的释放［21］，进而抑制痛觉信号的传导［22］，从而达到止痛效果。Mitragynine 和7-hydroxymitragynine 具有较高的亲脂性，比吗啡更容易突破血脑屏障，进入大脑产生药效［17］，等剂量摄入时，mitragynine 和7-hydroxymitragynine 的镇痛作用分别为吗啡的13倍和4倍［23］。

卡痛叶的毒理学效应与摄入剂量有关。摄入低至中等剂量（1～5 g）卡痛叶使人精力充沛、精神愉悦，具有减缓身体疲劳、提高社交能力和性能力的功效，起效时间一般在10 min以内并能维持1～1.5 h；摄入中等至高剂量（5～15 g）卡痛叶则能产生类似于鸦片的兴奋效应［23］；摄入高剂量（15 g以上）卡痛叶能立即大量出汗、头晕、恶心和烦躁等，随后产生与吗啡类似的镇静、麻醉效应，药效可维持6 h左右［24］。长期高剂量摄入卡痛叶，能使人产生焦虑、易怒、厌食、精神错乱和暴力倾向，突然中止摄入还会引起呼吸抑制、幻觉、恶心、自制困难等一系列戒断症状［25］。Trakulsrichai 等［26］通过对10 名饮用卡痛茶的男性受试者进行观察，发现所有受试者均出现了舌头麻痹、血压升高和心率加快的生理现象。

2.3 体内代谢过程

Mitragynine 具有复杂的体内代谢过程，其多种代谢物（如7-hydroxymitragynine、9-O-demethyl mitragynine）仍具有阿片活性，在体内发挥毒理作用。Philipp 等［27］首次报道了mitragynine 的体内代谢过程，检测了鼠尿和人尿中的mitragynine Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢产物，见表1。Mitragynine的代谢主要在肝脏中进行，代谢物主要为4 种单氧化物（包括7-hydroxymitragynine）和1 种去甲基化代谢物（9-O-demethyl mitragynine）［28］，主要代谢途径（图3）包括C7位上的羟基化、C16位上甲基的水解、C9上甲氧基团的O-脱甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等。其代谢过程受到4 种细胞色素P450（CYP450）酶CYP3A4、CYP2C19、CYP2C18、CYP2D6 的影响，CYP3A4 主要负责7-hydroxymitragynine 的生成，CYP2C19、CYP3A4 和CYP2D6 共同催化9-O-demethyl mitragynine 的生成，CYP2D6、CYP2C19 和CYP2C18 共同催化16-carboxy mitragynine 的生成，CYP2C19 主要负责9-O-demethyl-16-carboxy mitragynine 的生成［29］。此外，7-hydroxymitragynine 在人血浆中不稳定，可进一步转化为更有效的MOR 激动剂mitragynine pseudoindoxyl［30］，也可在体内代谢产生少量的mitragynine［31］。

表1 Mitragynine的体内代谢产物Table 1 Metabolites of mitragynine in vivo

图3 Mitragynine与7-hydroxymitragynine的主要代谢途径Fig.3 Metabolic pathways of mitragynine and 7-hydroxymitragynine

3 卡痛叶生物碱类活性成分的检验方法

3.1 常规检验方法

气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等是毒品的常规检验方法［32］，广泛用于可疑卡痛叶样品的鉴定和卡痛叶滥用案件中生物检材的检验，详见表2。

表2 卡痛叶主要生物碱类活性成分及代谢物的常规检验方法Table 2 Routine detection methods for the main alkaloid active ingredients and metabolites of kratom

3.1.1 气相色谱-质谱联用法2005 年气相色谱-质谱联用法（GC-MS）被首次用于卡痛叶生物碱类活性成分的检验［41］，Philipp等［42］应用GC-MS检验尿液中的卡痛叶生物碱类活性成分及其代谢物，在处理尿液样品时，以固相萃取提取目标物并使用双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化，mitragynine的检出限（LOD）为100 ng/mL。GC-MS操作简单，维护成本较低，是实验室检验卡痛叶生物碱类活性成分的常用方法，但其有一定局限性，如样品必须经过复杂的衍生化处理［43］，mitragynine 与其非对映异构体较难分离等。

3.1.2 高效液相色谱法液相色谱法分离效率高，通常使用C18色谱柱，常用检测器为二极管阵列检测器（DAD）和紫外检测器（UV），可满足生物检材中卡痛叶生物碱类活性成分及代谢物定性定量检测的需求。Neng等［44］应用高效液相色谱（HPLC）结合二极管阵列检测器（DAD）检验尿液中的mitragynine，采用棒吸附微萃取技术（BAμE）进行样本前处理，以改性N-乙烯基吡咯烷酮聚合物作为吸附剂提取目标物，方法回收率为97.7%～108%，线性范围为0.6～24 ng/mL，LOD 为0.1 ng/mL，定量下限（LOQ）为0.33 ng/mL。除易于操作和环境友好外，新的萃取技术不仅可提高mitragynine 的选择性，且在痕量水平上具有较高灵敏度。Sim等［45］应用HPLC法结合紫外检测器（UV）检验组织液中的mitragynine，采用优化的梯度洗脱方案，有效缩短了mitragynine 的出峰时间，改善了峰形，在0.5～10 μg/mL 线性范围内，方法的LOD 和LOQ 分别为0.47、1.43 μg/mL；在10～175 μg/mL 线性范围内，LOD 和LOQ 分别为4.29、13.01 μg/mL。该法性能稳定，相对标准偏差（RSD）小于2.0%。

3.1.3 液相色谱-质谱联用法液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和液相色谱-高分辨质谱法（LCHRMS）广泛用于复杂基质的药物分析。串联质谱（MS/MS）可实现目标物的多级确认，高分辨质谱（HRMS）可提供精确质量数，是液相色谱-质谱联用法中常用的分析技术。mitragynine 与其非对映异构体的裂解方式相同，使用常规液相色谱-质谱联用法检验卡痛叶生物碱类活性成分时，speciogynine、speciociliatine 与mitragynine 共洗脱，不利于mitragynine 的定量分析和阳性认定。Helander 等［46］通过改进梯度洗脱程序优化了LC-HRMS 方法，实现了mitragynine与其3种非对映异构体的基线分离（图4）。该方法的线性范围可达2 000 ng/mL，LOQ 为1 ng/mL。Basiliere 等［33］采用固相萃取和液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（LC-Q/TOF MS）检验尿液中的mitragynine、7-hydroxymitragynine 等5 种生物碱，实现了mitragynine 与其非对映异构体的完全分离，对mitragynine 的LOD 为0.25 ng/mL，LOQ 为0.5 ng/mL；为研究mitragynine 的Ⅱ相代谢物对Ⅰ相代谢物浓度的影响，该课题组［47］分别采用化学水解法和酶水解法处理尿液，并采用已建立的LC-Q/TOF MS 法进行检验。结果表明，酶水解法仅增加了16-carboxymitragyine 的浓度，化学水解则破坏了尿液中游离的Ⅰ相代谢物。

图4 目标物梯度洗脱流程图及标准样品色谱图［46］Fig.4 The gradient elution flow chart of the targets and chromatogram of the standard sample［46］

3.2 快速检验方法

3.2.1 质谱法常规的气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法仪器设备复杂，对操作人员有较高的专业和技术要求，样品前处理步骤也增加了整体分析时间。敞开式电离质谱（AIMS）工作流程简便，无需或仅需简单样品前处理，简化了工作程序和分析时间，显著提高了分析效率。Voelker等［48］分别采用便携式实时热解吸质谱仪（DART-TD-MS）和手持式质谱仪（MX908）检验卡痛叶粉末样品。实时直接分析（DART）技术作为一种原位电离技术无需样品前处理，只需将样品收集器按压在卡痛叶粉末样品包装内部即可进行样品分析，对mitragynine 的最低检测水平（MDL）可达200 ng，数据采集时间为20 s，数据处理用时为30 s，是一种快速的现场筛查技术；手持式MX908 由样品导入模块、常压化学电离源和小型化离子阱质量分析器组成，具有板载数据存储和处理功能，设备体积小、功耗低，但由于检测时直接进样会导致背景信号增强，因此需要用氯仿溶解粉末样品，再进行涡旋离心过滤，MX908检测mitragynine的MDL可达80 ng，样品分析用时仅需45 s。

目前，便携式质谱仪在卡痛叶生物碱类活性成分检验时尚存在一定的误检率，可通过与便携式傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）或便携式离子迁移谱联合使用［48］，有效验证分析结果，提高现场检测的可靠性。

3.2.2 免疫分析法免疫分析法利用抗原与抗体之间的特异性亲和反应来检验目标物。Mitragynine缺乏免疫表位，需要首先与载体蛋白（如阳离子牛血清白蛋白（sBSA）、卵清蛋白（OVA）等）结合形成免疫原，之后将其注射到家兔或小鼠体内以获得单克隆或多克隆抗体。Limsuwanchote 等［49］将mitragynine 的羧酸化衍生物（MGA）与载体蛋白BSA 偶联制备免疫原，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定半抗原数量验证了MGA-BSA 具有良好的免疫原性。用MGA-BSA 免疫小鼠并构建杂交瘤1A6 产生抗体MAb 1A6，研究表明，该抗体与生物碱speciogynine、paynantheine 和mitraciliatine 的交叉反应活性分别为30.54%、24.83%和8.63%。利用该抗体建立测定mitragynine 的间接竞争酶联免疫吸附法（icELISA），方法线性范围为32.92～250 μg/mL，LOD为32.47 μg/mL，其定量结果与高效液相色谱法具有良好的相关性（r2= 0.994），是检测卡痛叶中mitragynine 的有效工具；四年后，该课题组又研发了竞争性的侧流免疫层析试纸［50］，将抗mitragynine 单克隆抗体与胶体金的结合物作为识别探针，在试纸条上固定mitragynine 与卵清蛋白的偶联物作为测试区，羊抗鼠IgG 抗体作为对照区，待测样品中mitragynine 的含量与测试区颜色强度呈反比，见图5。该试纸条的检测灵敏度低于icELISA，仅为1 mg/mL，在低温（4 ℃）下可稳定保存两个月，具有便携、结果直观、易解释等优点。

图5 Mitragynine免疫层析试纸示意图［50］Fig.5 Schematic description of the mitragynine immunochromatographic strip［50］

多克隆抗体具有同时检测多个表位的能力，可实现更稳健的检测和更高的灵敏度。Mustafa等［51］使用多克隆抗体建立了检测mitragynine 的icELISA，在制备抗体时比较了不同的抗体修饰策略，发现抗体在C22-MG-cBSA 上表现出更高的结合亲和力，灵敏度显著提高。该方法的线性范围为0.01～10.00 μg/mL，LOD 和LOQ分别为0.041 2、0.124 μg/mL。

3.2.3 其他快检方法近几年，便携式光谱仪器因体积轻便、操作简单、分析快速，受到研究人员的广泛关注。手持式拉曼光谱仪无需样品暴露，场地适应性强，是缴获样品现场分析的有力工具。Lanzarotta 等［52］使用5 台手持式拉曼光谱仪（1 064 nm）结合表面增强拉曼光谱（SERS）技术检验卡痛叶粉末样品中的mitragynine，SERS显著增强了mitragynine 的光谱信号，该方法的LOD 小于342 ng/mL，真阳性率为99.3%，真阴性率为97.9%。FTIR 扫描速度快，光谱范围宽，光通量大，具有较高的准确度和灵敏度。Voelker等［48］评估了Nicolet iS5便携式FTIR 对卡痛叶粉末的鉴别能力，样品经氯仿提取后检验，检测的含量范围为12.7～69.3 mg/g，仪器的识别准确率为99.5%。

免疫传感器是以抗体或抗原作为敏感元件的生物传感器，将传统的免疫测试和生物传感技术结合，减少了分析时间，提高了测试精度，具有高度特异性、稳定性、小型化以及基于光学、质量或电化学技术的不同检测器的应用灵活性。Mustafa 等［53］利用抗mitragynine 多克隆抗体开发了基于icELISA 的电化学免疫传感器，并首次用于现场尿液中mitragynine 的检验，采用多壁碳纳米管（MWCNT）/壳聚糖（CS）纳米复合材料用作传感器制造的改性剂，显著提高了电极性能，并通过酶促反应产生电化学信号。该方法的线性范围为0.001～10 μg/mL，LOD为0.018 μg/mL，LOQ为0.06 μg/mL。

4 结 语

目前，卡痛叶在全球范围内流行，滥用形势愈发严峻，对其生物碱类活性成分的检验和鉴定具有越来越重要的意义。本文综述了卡痛叶生物碱类活性成分的药理毒理作用、体内代谢过程以及检验方法的最新研究进展。卡痛叶的主要生物碱类活性成分为mitragynine 和7-hydroxymitragynine，通过与体内阿片受体结合产生作用，具有多种代谢途径和代谢产物。其常用的检验方法有气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。质谱法、免疫分析法、便携式光谱仪和免疫传感器可用于卡痛叶的现场快速分析，其中AIMS是一种新型质谱技术，具有实时、原位、高通量、简便快速等优点；ELISA 是目前最流行的免疫分析法，设备体积小、线性范围宽、安全性好，但抗体可能与其他结构类似物产生交叉反应；相同的抗体条件下，电化学免疫传感器的灵敏度比ELISA 高10倍，检测速度更快，试剂用量少，更适用于卡痛叶的现场检测。

在今后的研究中应注重开展以下工作：一是提高对mitragynine 及其结构类似物的分离能力，不断优化色谱条件，或建立超临界流体色谱（SFC）等手性分离能力更好的实验室分析方法；二是关注卡痛叶中的其他相关生物碱，研究其药理毒理作用，通过分析体内代谢途径及各种药物代谢酶的关系，预测潜在的药物相互作用，分析代谢产物对人体产生的影响；三是开发现场快速检测卡痛叶生物碱类活性成分的AIMS方法，改进电离方式，降低误检率，提高对生物检材的分析能力；四是通过结合先进纳米材料和逆反射光学信号标签等先进传感元件，进一步研发适用于卡痛叶现场分析的高灵敏度和特异性的免疫传感器。