不同酵母发酵对蓝莓酒风味影响的研究

◎ 徐子雯，陈舒悦，罗怡婕，周钰雯，张慧恩

（浙江万里学院，浙江 宁波 315100）

酒是人类生活中重要的饮品之一。中国酒文化历史悠久，博大精深，早在几千年前，中国人就创造出独特的酒曲复式发酵法并用于大量酿造黄酒。如今，酒对于中国人来说，已不仅仅是食物，更是一种融合物质生产和精神创作的饮食文化[1-3]。

现代酒类产业快速发展，酒类的产量销量与市场规模不断扩大。目前，市场上受欢迎的酒类主要有白酒、啤酒、果酒。在果酒领域内，蓝莓酒虽属小众品类，但也拥有悠久的酿造历史，早在明代就有了蓝莓酒可美容养颜、抵御湿寒、活血化瘀、强身健体等功效的文献记录。因此，自古以来，蓝莓酒就被认为具有美容的神奇功效，并一直流传至今。现代科学已经确定，经过发酵后的蓝莓酒可以刺激更多活性成分的产生，蓝莓酒不仅味道比蓝莓和蓝莓汁更吸引人，而且其含有的花青素和其他营养物质更易被身体吸收。相较于其他的酒类，饮用蓝莓酒更有利于身体健康。在欧洲，蓝莓酒被誉为“给人类寿命带来第三次飞跃”的神奇之物。不同于在欧洲的知名度，蓝莓酒在中国是个鲜为人知的小众酒类，远不如葡萄酒的市场知名度。由于最近几年酒类市场迎来消费升级转型，使得市场更偏年轻化，更易接受新奇酒类，消费者更加注重酒类风味多样化、低酒精度数及健康饮酒，蓝莓酒因此打开了中国市场[4]。

当前，顶空固相微萃取-气质谱联用（HSSPME-GC/MS）技术已应用于各种类型酒样（如葡萄酒、红酒和白酒等）中挥发性香气成分的分析[5]。此外，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLSDA），都是利用原始数据呈现组间及组内差异的可视化技术，可从不同维度反映不同样本间的代谢组成的差异[6]。

虽然近几年酒类风味物质的研究受到学者的高度关注，但是相较于其他酒类，蓝莓酒的相关研究还比较少。尽管近几年蓝莓酒越来越受到消费者的青睐，但是少有聚焦于蓝莓酒中挥发性风味物质和蓝莓酒的主要香气特征的研究。基于此，本文利用气相色谱质谱联用仪结合代谢组学对不同酵母发酵蓝莓酒风味物质的影响进行研究，旨在全面了解和认识不同酵母对于蓝莓酒风味物质的基础差异，从而选择最适合酿造蓝莓酒的酿酒酵母，为以后有关蓝莓酒香气物质的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

气相色谱质谱联用仪8890-5977B（安捷伦公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取头及萃取手柄（美国 Supelco公司）；电子天平B124S（赛多利斯有限公司）；磁力加热搅拌器RT2（赛默飞公司）。

1.2 材料与试剂

蓝莓：购于奉化蓝莓基地，充分成熟，采摘后立即于-18 ℃保存；酵母AU、DE、RA购自烟台帝伯仕自酿机有限公司；氯化钠（分析纯）购于国药集团。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓酒的发酵工艺流程

基本工艺流程：蓝莓果→挑选→解冻→打浆→调整成分（添加偏重亚硫酸钾、蔗糖、碳酸钙）→接种酵母→装罐→主发酵→倒罐→陈酿→成品酒。

1.3.2 挥发性风味物质的测定

萃取条件：取5.0 mL蓝莓酒样，加入20.0 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl，在水浴锅中50 ℃平衡10 min，将SPME手动进样柄（萃取头型号：50/30 μm PD-MS/DVB/CAR）插入进样瓶中，50 ℃萃取30 min，取出萃取头插入气相色谱仪进样口，解析5 min后取出[7-8]。

GC 条件：HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流进样，柱温采用程序升温，50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至90 ℃保持1 min，再以1 ℃/min升至100 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃保持1 min，最后以6 ℃/min升至250 ℃。进样口温度250 ℃，载气为氦气，流速1.0 mL/min[9-10]。

MS 条件：电离方式 EI，电离电压 70 eV，离子源和四极杆的温度分别为230 ℃和150 ℃灯丝电流 0.25 mA，电子倍增器电压为1 500 V，扫描范围40～550 m/z[11]。

1.3.3 数据处理

①定性分析。通过检索与NIST17标准谱库进行比对，选择匹配度≥70%的物质为有效物质。②定量分析。采用峰面积归一法计算。③主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），由MetaboAnalyst网站进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同酵母蓝莓酒风味物质分析

（1）利用GC-MS对3组不同酵母发酵的蓝莓酒中的风味物质进行采集和数据分析。经NIST 17.0数据库检索后，共鉴定出76个化合物（见表1）。按照其化学结构性质可分为5类，包括有机酸类、酯类、醇类、萜烯类、酚类。其中，醇类26种，酯类15种，酸类15种，萜烯类13种，酚类7种。3种酒中醇类和酸类物质占比最多，其次是酯类。醇类物质是果酒香气的主要成分，醇类物质能够促进酯类物质香气成分的散发，使酒体更加饱满[12-13]。

（2）3 种酒样含量较高的主要香气成分为异戊醇、苯乙醇、异丁醇、芳樟醇、α-松油醇。异戊醇具有酒精味和特殊的指甲油的味道[14]；芳樟醇和苯乙醇具有玫瑰花香[15]。RA酵母酿造蓝莓酒中醇类占比最高，对感官风味影响较大；DE酿造的蓝莓酒醇类物质含量最低，这是由于酿酒所用酵母不同导致的。

（3）酯类是赋予果酒丰富果香、花香的物质，与果酒整体风味的呈现具有重要关系。蓝莓酒中主要酯类物质有丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯等，这些酯类物质增加了酒体的果香与花香。结果显示，AU酵母酿造蓝莓酒中酯类占比最高，其次是DE。

（4）蓝莓酒中含有较多的有机酸，主要来自蓝莓鲜果。有机酸能够影响蓝莓酒的酸甜比，对酒的口感具有较大影响。当酸类含量过高时，会大大降低果酒的香味，口感舒适度降低；当酸类含量较低时，能够带来清爽的口感，增加酒体的复杂性。相比较DE酿造的蓝莓酒有机酸含量最低，AU酿造的蓝莓酒有机酸含量有所增加。

2.2 蓝莓酒风味物质PCA和PLS-DA分析

（1）PCA分析是无监督的，即PCA分析并不考虑样品的分组信息。PCA的目标是选择几个相互独立的因子代表所有代谢物，这些因子保留了关于原始代谢物变异的最大信息量。对此，本研究选择保留最多信息的2个因子，并构建一个散点图，显示一组代谢物的样本之间的结构差异[16]。

（2）进行PCA主成分分析利用之前提取到的化合物，了解三组蓝莓酒之间的总体化合物表型差异。结果表明，3种不同酵母的蓝莓酒前2个主成分PC1和PC2的累计方差贡献率达69.7%（如图1），这说明主成分很好地概括了样品的原始数据信息。其中，PC1占48.5%，PC2占21.2%。PCA模型包含4个主成分，拟合参数为R2X=0.924、Q2=0.860，图中3组样品明显分布在不同区域，区分显著，说明3种蓝莓酒的风味物质组成结构差异。

图1 PCA主成分分析得分图

（3）除了无监督模式的主成分分析PCA以外，本试验还使用Metaboanalyst对所有样本建立偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。判别最小二乘分析是受控的，即分析时需要聚类信息，PLS-DA可用于寻找样本组间最大可能差异的因子。判别分析将要预测的连续分类变量编码为潜变量，在解释变量和潜变量之间建立回归，并使用最小二乘回归理论求解。PLS-DA通过将预测变量和观测变量分别投射到一个新的空间来寻找线性回归模型，这表明PLS-DA模型的判别能力更强[17]。其中，变量重要性因子（VIP）可以量化每个变量对分类的贡献。当 VIP 值>1 时，对应变量可定义为判别模型的关键变量，VIP值越大，对模型的重要性越大[18]。

PLS-DA的得分图（见图2）表明3组蓝莓酒有明显的分离，PC1和PC2分别解释了总方差的46.3%和23.0%，3组蓝莓酒的点云分布在不同的区域，PLSDA 模型包含2个主成分，拟合参数为R2X=0.825、Q2=0.629。R2X越接近1表明模型越稳定，Q2>0.5 表明预测率较高[19]。

图2 PLS-DA分析得分图

根据 VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）筛选出关键挥发性成分，结果显示共筛选出15种差异挥发性物质（见图3）。其中，有机酸4种，酯类2种，醇类3种，萜烯类4种，酚类2种。分别为己酸、辛酸、壬酸、3-氨基丁酸、乙酸异戊酯、丁二酸二乙酯、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、薄荷醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜品醇、2,4-二叔丁基酚、3,5-二叔丁基苯酚。

图3VIP图

2.3 蓝莓酒的感官评价

感官品评是评价食品感官质量最有效、最直观的方法，特别是在酒类食品中，感官评价是任何先进仪器无法替代的[20]。本次试验将综合10名受过训练的食品专业学生的得分求取平均值，尽量减小试验误差。由表2可知，蓝莓酒外观澄清透明，呈宝石红色。其中，AU蓝莓酒颜色为悦人深紫宝石红色，果香浓郁，平衡性好；DE蓝莓酒果香浓郁但颜色较浅；RA蓝莓酒颜色悦人但协调性略显薄弱。综合相关评语和得分可以看出，AU蓝莓酒从色泽、香气、口感和典型性方面表现突出、果香浓郁、协调性好、品质最佳。感官评价得分如2.2所述，本研究根据 VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）筛选出关键挥发性成分存在一定的内在联系，其中，α-松油醇VIP值最大，在AU蓝莓酒中含量最高，可能是影响感官评价得分的关键物质。

表2 不同酵母蓝莓酒感官评价表

3 结论

本研究采用3种不同酵母酿造的蓝莓酒，通过顶空固相微萃取-气质谱联用（HS-SPME-GC/MS）技术共鉴定挥发性化合物76种，经数据处理归纳总结后可以发现，有3种不同酵母的蓝莓酒间有41种相同的化合物，说明3种蓝莓酒的挥发性风味物质在种类上具有一定的差异性。在此基础上，本研究利用PCA和PLSD-DA对风味物质进行分析，均能验证3组蓝莓酒存在整体差异，能够被完全区分开来，并找出15种差异风味物质，其中，α-松油醇VIP值最大。从感官评价来看，AU蓝莓酒得分最高，RA蓝莓酒得分最低，原因在于AU蓝莓酒中α-松油醇含量最高，可能对风味起着较为显著的作用。综上所述，AU酵母比其余2种酵母更适合用于酿造蓝莓酒。