茼蒿水提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用研究

程明明 黄苇

金黄色葡萄球菌属于革兰氏染色阳性（G+），是一种机会性病原体，可感染人体不同部位而导致多种感染性疾病。随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的疾病治疗困难，与此同时，MRSA还能通过逃避免疫细胞的攻击，造成严重的慢性感染及迁延不愈。于是，探索和开发安全性更高、毒副作用更小、抑菌范围更广的天然抑菌药物逐渐成为新的研究热点。

茼蒿（crowndaisy chrysanthemum）是一种具有药食两用功效的菊科茼蒿属草本植物，含有黄酮、酚酸、倍半萜内酯等多种化合物，具有很好的生物活性。李珊珊等研究发现，茼蒿水浸液对枯萎病菌有很好的抑制作用，但对MRSA抑制效果的研究尚未见报道，本课题利用茼蒿水提物，研究其对MRSA生长的抑制作用。

一、材料与方法

1.材料与试剂。（1）菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003），购自于中国医学细菌保藏管理中心。

（2）试剂：二甲基亚砜（DMSO），天津市科密欧化学试剂有限公司；LB肉汤培养基，北京陆桥技术股份有限公司；碘乙酸，北京索莱宝科技有限公司；丙二酸，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）。

2.仪器与设备。ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司；ZD-3A电导率仪，上海安亭电子仪器厂；G3旋转蒸发器，北京博医康试验仪器有限公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-ZFD 超净工作台，苏州净化设备有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

3.试验方法。（1）茼蒿水提物（AECC）。将茼蒿切成碎块，称取15kg分别用6倍和10倍的蒸馏水蒸煮1h，过滤，合并滤液，以95%乙醇沉淀并静置24h。过滤，再将滤液利用旋转蒸发仪进行浓缩就可得到茼蒿水提物，置于5℃冰箱保存备用。（2）抑菌圈的测定。利用琼脂盘扩散法测定抑菌圈。（3）最低抑菌浓度（MIC）的测定。采用2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）法测定提取物对金黄色葡萄球菌的MIC，观察菌液颜色，以完全清除红色时的提取物浓度作为MIC。（4）AECC对MRSA生长的影响。采用比浊法进行测定，具体操作如下：取MRSA悬液加入AECC（0.5mg/mL），以不添加AECC为空白对照组，置于37℃下振荡培养，并分别测定不同时间段菌悬液的OD600。（5）AECC对MRSA生物被膜的清除作用。采用结晶紫染色法和菌落计数法测定不同浓度AECC处理24h和72h对MRSA生物被膜的清除作用。（6）钾、镁离子含量测定。用酶标仪检测各组上清液中钾离子（OD440）、镁离子（OD540）的含量。

4.数据统计分析。样品做3次平行试验，并且利用OriginPro 8进行统计学数据处理分析，数据用“平均值±”表示。

二、结果与分析

1.AECC对MRSA抑菌圈的影响。抑菌圈能在一定程度上反映药物的抑菌效果，一般抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。由图1可知，AECC对金黄色葡萄球菌的抑菌圈的平均直径为11.15mm，说明AECC对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制能力。

图1：AECC对MRSA抑菌圈的影响

2.MIC测定结果分析。TTC法是细菌检测中常用的一种方法，通过观察反应液的颜色确定提取物的最低抑菌浓度。TTC在氧化状态下一般是无色的，但活菌中的脱氢酶会使其氧化成粉红色，所以恰好使粉红色沉淀物消失的浓度即为最低抑菌浓度。由图2可知，AECC在0.5mg/mL时反应液内未观察到粉红色沉淀物，因此确定AECC对MRSA的MIC为0.5mg/mL。

图2 ：AECC对MRSA最低抑菌浓度的测定

3.AECC对MRSA生长的影响。生长曲线是用来描述细菌生长状况的常用指标，一般情况下，细菌生长过程中悬浮液中细菌的数量与悬浮液成正比，故可以用浑浊度来间接反映细菌的数量。由图3可知，在前2h，空白组和AECC处理组OD600值差异不大，但随着时间增加到3h，空白组的MRSA进入对数生长期，繁殖速度非常快，并且在18h达到峰值；反观AECC处理组，MRSA只出现小幅度的增加，生长较为平缓，并未出现对数生长期。由此可见，AECC可以通过影响MRSA的对数期生长，从而发挥一定的抑制或者灭杀作用。

图3：AECC对MRSA生长的影响

4.AECC对MRSA生物被膜的清除作用。生物被膜是细菌的菌体相互黏附或黏附于接触表面被胞外分泌聚合物包裹而形成的具有一定空间结构的聚集体，细菌能利用生物被膜而对诸如渗透压和消毒剂等恶劣的环境条件有更高的抵抗力。由表1可知，MRSA培养24h和72h的生物被膜含量都在逐渐下降，在1MIC浓度下，生物被膜清除率分别为23.99%和13.06%，表明AECC对MRSA的成熟生物被膜具有一定的清除作用，并且随着AECC浓度的增加，清除的效果越好。

5.钾、镁离子含量的测定结果分析。由图4可知，AECC处理后，混悬液的K+和Mg2+浓度都有所增加。1/2MIC的K+和Mg2+浓度与空白组相比差异不显著（P>0.05），1MIC、2MIC的K+和Mg2+浓度显著高于空白组（P<0.01），可见AECC处理后，K+和Mg2+也发生了明显的外泄，说明AECC能明显破坏细胞膜的完整性。

图4：AECC对K+、Mg2+的影响

*，#表示差异显著（P<0.05）；**，##表示差异极显著（P<0.01）

三、结论与讨论

本课题以茼蒿水提物（AECC）为对象，研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果显示，AECC能够显著抑制MRSA的生长，对MRSA的最小抑菌浓度为0.5mg/mL。同时发现，AECC对MRSA生物被膜形成具有一定的抑制和清除效果，并且K+和Mg2+浓度能达到极显著水平（p<0.01）。综上所述，AECC对MRSA具有很好的抑制效果，并且很可能是通过影响细菌膜的通透性，对金黄色葡萄球菌产生抑制作用。

基金项目：九江市重点研发计划 （S2022ZDYF308）。

作者简介：程明明（1988-），男，汉族，江西九江人，工程师，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。

*通信作者：黄苇（1967-），女，汉族，貴州贵阳人，教授、硕士生导师，博士，研究方向为食品安全与质量控制。