坏死性凋亡经典通路在心血管疾病中的研究进展

李唯嘉,荣书玲,李 保

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球重大的公共健康问题[1]。CVD的病理过程涉及多种细胞死亡形式,在受到非致死性应激或损伤时,心肌细胞主要发生程序性心肌细胞死亡[2]。程序性细胞死亡作为一种由基因决定的有序、主动死亡,包括凋亡、焦亡、铁死亡和坏死性凋亡(necroptosis)。坏死性凋亡参与了多种CVD的发病过程,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤、心肌梗死(myocardial infarction,MI)、病理性心室重塑和心力衰竭(heart failure,HF)中发挥重要作用。近年来,坏死性凋亡的信号通路、相关分子机制研究也取得了重要进展。

坏死性凋亡是非半胱天冬氨酸酶(Caspase)依赖的可调控性细胞坏死,具有细胞凋亡和坏死的一些共同特征,主要表现为细胞肿胀和细胞膜完整性的破坏,可引起炎症反应[3]。坏死性凋亡由死亡受体介导,被与受体相结合的配体激活,其中,参与肿瘤坏死因子-α/肿瘤坏死因子受体(TNF-α/TNFR)诱导途径的蛋白如受体相互作用激酶1(receptor interacting protein-1,RIP1)、受体相互作用激酶3(receptor interacting protein-3,RIP3)和底物混合谱系激酶样蛋白(mixed lineage kinase-like domain,MLKL)等是坏死性凋亡的关键分子,RIP1-RIP3-MLKL通路也被称为坏死凋亡的经典通路,许多药物和化合物通过作用于RIP1、RIP3、MLKL等坏死性凋亡关键分子抑制程序性坏死的发生[4]。

因此,明确心肌细胞坏死性凋亡的分子机制,探究坏死性凋亡在CVD的病理生理过程中的作用,对于寻找新的干预方式及治疗靶点,有效降低CVD的死亡率,改善心血管病人的预后,具有重要的临床意义。本研究针对坏死性凋亡的经典信号通路RIP1-RIP3-MLKL、抗坏死性凋亡相关治疗药物及这一通路在CVD中的研究进展进行综述。

1 坏死性凋亡的经典信号通路及其在CVD中的作用

1.1 RIPs是坏死性凋亡中的重要调控分子

RIPs是一类具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的蛋白。在结构上,这类蛋白N端具有高度保守的激酶结构域,因此RIPs具有相同的生物学功能。RIPs可以接受细胞表面受体传递的细胞外刺激及来自细胞内模式识别受体的信号,启动下游级联反应,激活转录因子,而其中一些因子被激活后可以协助死亡信号的转导,导致细胞死亡[5]。RIP蛋白家族具有许多成员,包括RIP1～7,其中RIP1和RIP3两种蛋白在坏死性凋亡中有重要作用。

1.2 坏死性凋亡的经典通路

坏死性凋亡由死亡受体诱导发生,包括TNFR家族(如TNFR1、TNFR2、TRAILR、Fas/CD95)、病原体识别受体[如Toll样受体(TLR)3、TLR4,NOD样受体]、干扰素受体(IFNR)、干扰素调节因子(DAI)的DNA依赖性激活剂以及细胞内的RNA或DNA感受器等[6]。这些死亡受体与其各自的配体结合,启动坏死性凋亡途径。坏死性凋亡涉及多种信号通路,其中研究最为广泛、最经典的是由TNF-α/TNFR途径诱导的RIP1-RIP3-MLKL通路,该过程可以被简述为:当TNF-α与TNFR1结合,TNFR1被激活后与RIP1、肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)、FADD/E3泛素化连接酶、TRAF2/5、细胞凋亡蛋白-1的细胞抑制剂cIAP1/2共同形成复合物I,RIP1在此过程中泛素化,活性受到抑制,NF-κB通路被激活,利于细胞生存。复合体I中的RIP1去泛素化后被激活并从中解离,在胞浆中招募Csapase-8(外源性凋亡途径的启动因子,当被抑制或敲除时激活坏死性凋亡)等。当三磷酸腺苷(ATP)充足时,Caspase-8活化,此时RIP1和RIP3失活,阻断坏死性凋亡通路,同时凋亡通路被激活,最终导致细胞凋亡;当ATP缺乏时,Caspase-8活性减低,RIP3和RIP1结合,形成RIP1-RIP3复合物招募并磷酸化下游的MLKL;活化的MLKL与磷脂酰肌醇磷酸盐、磷脂酰甘油和心磷脂结合,形成坏死性复合体,并易位到细胞膜,其中的MLKL引起细胞膜透化、细胞肿胀,细胞释放内源性危险信号损伤相关分子模式,启动免疫应答,导致炎症反应发生[7]。

此外,随着研究的不断深入,除了TNF-α介导的经典坏死性凋亡外,RIP1和RIP3可以激活线粒体应激通路介导坏死性凋亡的发生,如RIP1介导的RIP1-MEK/ERK通路,RIP3介导RIP3-c-Jun氨基末端激酶(JNK)-BNIP3、RIP3-PGAM5-Drp-1、RIP3-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-线粒体膜通透性转换孔(mPTP)通路等[8]。研究发现,CaMKⅡ可能作为MLKL的下游效应因子,并参与了心肌I/R损伤过程中的坏死性凋亡[9]。RIP3还可以激活内质网应激通路介导坏死性凋亡发生,如RIP3-XO-活性氧(ROS)-mPTP信号通路[10]。但是这些信号转导分子机制目前并未完全阐明,仍需要深入研究。

2 抗坏死性凋亡药物在心肌损伤治疗中的作用

2.1 RIP1抑制剂

坏死抑素-1(necrostatin-1,Nec-1)是发现最早、应用最广泛的一种RIP1特异性抑制剂[11]。Nec-1已经广泛应用于RIP1参与的各种细胞坏死和疾病[12]。Nec-1通过阻断RIP1磷酸化有效地阻断RIP1-RIP3-MLKL信号转导,从而抑制细胞发生坏死性凋亡。在许多疾病模型中,如MI、精神疾病和肠道炎性疾病等,Nec-1被证实不仅抑制RIP1,还能降低RIP3的表达和磷酸化[13]。然而,Nec-1并不是直接抑制RIP3且不会阻断RIP3自磷酸化,而是通过减少RIP1和RIP3之间的相互作用,抑制RIP1-RIP3复合体的形成和降低复合体稳定性,从而影响下游RIP3的活性[14]。

研究证实,ROS的产生可能是RIP1依赖性的,ROS增加RIP1/RIP3的表达,并能增强RIP1-RIP3复合体的稳定性;Nec-1还通过靶向ROS影响坏死性凋亡;在急性I/R损伤疾病模型中,Nec-1可以降低损伤细胞内ROS水平,这种下调甚至可以将损伤细胞ROS降至与正常细胞相似的ROS水平[15]。因此,Nec-1被广泛应用于MI、AS、糖尿病心肌病等。除了Nec-1,Harris等[16]还在化学筛选中发现了其他几种RIP1抑制剂,如GSK2982772,但尚在临床试验阶段,其药理机制有待深入研究。

2.2 RIP3抑制剂

RIP3作为RIP1的下游信号分子,直接靶向作用于MLKL,在整个信号通路中非常重要。因此,与RIP1激酶抑制剂相比,RIP3激酶抑制剂在坏死性凋亡中的作用更为重要。Li等[17]研究发现,一类传统上用于治疗转移性黑色素瘤的B-Taf抑制剂(VE600)在抑制RIP3方面也有一定的效果,其中,一类化合物如达拉非尼通过竞争性抑制ATP与RIP3酶相结合,减少RIP3介导的MLKL磷酸化,破坏RIP3和MLKL之间的相互作用,但是目前尚未应用于CVD研究[18]。还有一些抗癌药物如帕纳替尼可以同时抑制RIP1和RIP3抑制坏死性凋亡。

2.3 MLKL抑制剂

MLKL可以作为预防细胞坏死性凋亡、抑制坏死性凋亡后严重的炎症反应的最佳治疗靶点,但是针对MLKL抑制剂的报道较少。坏死磺胺是MLKL抑制剂,目前仍应用于动物或细胞模型中。除了抑制经典通路的药物,还有一些如褪黑素可以减少MI面积,其机制可能是通过抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信号通路,减少mPTP的开放,抑制心脏I/R损伤后心脏微血管内皮细胞坏死性凋亡[19]。

随着对坏死性凋亡药物研究的不断深入,一些药物如达拉非尼等可用于治疗特定临床疾病。然而,大多数研究靶向坏死性凋亡的药物及治疗效果都仅停留在体外实验或动物模型阶段。因此,这些化合物和药物临床使用可行性仍有待进行体内试验和临床试验评估。

3 坏死性凋亡与CVD的关系

3.1 坏死性凋亡与AS

AS累及大中肌性动脉,AS斑块造成动脉壁增厚变硬、血管狭窄,不稳定斑块破裂堵塞器官或四肢血管管腔,引发心脑血管疾病及并发症。AS与脂质代谢密切相关,在血脂异常的因素中最重要的是过量的低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL),尤其是氧化型LDL(ox-LDL),氧化应激(oxidative stress,OS)可以加速LDL沉积在动脉内膜。LDL在ROS的作用下成为ox-LDL,ox-LDL刺激血管内皮细胞分泌炎性因子,诱导单核细胞与内皮细胞黏附,单核细胞转化成巨噬细胞。ox-LDL还可以诱导巨噬细胞摄取脂蛋白,形成巨噬泡沫细胞,而巨噬细胞死亡是AS斑块形成坏死的主要因素,坏死的斑块容易破裂[20]。过去的研究多集中于ox-LDL有细胞毒性并能诱导平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡及凋亡细胞过早清除引起的继发性坏死。近年来,关于在AS斑块形成的过程中,巨噬细胞在坏死性凋亡中的作用也取得了一些进展。

目前研究认为,巨噬细胞坏死性凋亡途径可以作为不稳定动脉粥样硬化斑块诊断和治疗的靶点。研究显示,在AS小鼠模型中,敲除RIP3基因的小鼠较对照组小鼠动脉粥样斑块的体积明显缩小,病灶中坏死性凋亡的巨噬细胞较少,炎症较轻,但是凋亡细胞的数量无明显差异;进一步研究发现,RIP3和载脂蛋白E双基因敲除的小鼠,动脉粥样硬化斑块中炎症反应及坏死性凋亡水平明显下降[21]。Karunakaran等[22]研究表明,AS病人的颈动脉斑块巨噬细胞中RIP3和MLKL的表达显著增加,并且检测到磷酸化的MLKL,提示RIP3、MLKL与AS密切相关,且坏死性凋亡的激活及RIP3、MLKL基因表达上调可能增加斑块的不稳定性,从而参与AS的病理过程,提早干预RIP3基因表达,可能会阻断AS的病理进程;通过使用开发的新型Nec-1放射性示踪剂,可以特异性定位于小鼠的AS斑块,提示Nec-1靶向治疗AS的坏死性凋亡可能是一种有效的策略。然而,有研究表明,MLKL基因敲除后,小鼠血中胆固醇水平降低,但增加了AS斑块内和体外巨噬细胞源性泡沫细胞中脂质的累积,这可能是由于内体运输缺陷导致的,目前尚无定论[23]。

3.2 坏死性凋亡与MI

MI是指冠状动脉受到持续且严重的闭塞,心肌细胞持续性缺血缺氧,发生不可逆的死亡。而挽救缺血心肌的唯一方式是恢复血液灌注,即在冠状动脉部分或完全梗死后一定时间内血液再次灌流,缺血的心肌虽然供血得以恢复,但心肌细胞坏死仍不可避免,超过一段时间再进行灌注会导致额外的不可逆损伤,加重梗死过程(致死性再灌注损伤)。在离体大鼠I/R模型中,使用Nec-1可以有效减小MI面积,改善心功能[24]。因此,深入研究坏死性凋亡的发生和调控对防治I/R及MI意义重大。研究表明,I/R后,小鼠心脏标本中RIP1、RIP3、MLKL的蛋白水平明显升高;小鼠的非再灌注MI模型中RIP3也显著上调。在RIP3基因敲除小鼠永久性左前降支结扎术,I/R后检测小鼠心脏中RIP3显著上调,ROS和其他炎症反应也升高,在梗死3 d后左室射血分数升高,心肌肥大被抑制,提示RIP3介导MI后的不良重塑[25]。RIP1-RIP3-MLKL在MI病理生理过程及预后中发挥重要作用。

然而,随着研究的深入,Chang等[26]研究显示,MLKL在RIP3诱导的I/R坏死性凋亡中作用有限,提示还存在其他非经典通路参与这一过程。在高糖诱导的急性MI模型中,蛋白磷酸酶抑制剂可以通过抑制RIP3-CaMKⅡ介导的ROS,减轻坏死性凋亡。Zhang等[27]研究显示,在大鼠心肌I/R损伤模型中,RIP3通过直接激活CaMKⅡ,引起mPTP开放,细胞内Ca2+浓度升高,促使心肌细胞坏死,这一过程与RIP1、MLKL无关,但此研究存在一定局限性。Yang等[28]研究显示,MLKL和CaMKⅡ均参与RIP3诱发的心肌缺血引起的慢性胸痛,心肌I/R损伤可以由RIP1-RIP3-MLKL和RIP3-CaMKⅡ这两条途径共同参与,其中,CaMKⅡ被确定为RIP3的新型底物,在未来的研究中更具有价值。此外,还有几种microRNA(miRNAs)也可以调节心脏I/R后的坏死性凋亡。miR-223被认为是I/R损伤和心肌坏死性凋亡的潜在调节因子,可以减小梗死面积及坏死标志物的生成;miRNAs调节受到RIP1、RIP3、MLKL蛋白水平的影响;miR-873作用机制与miR-223相同,都是坏死性凋亡的负性调节因子;miR-103、miR-107s可以促进坏死性凋亡,详细机制有待进一步研究[29]。这些miRNAs可能作为减轻I/R损伤的新靶点,有助于治疗缺血和OS诱导的心肌损伤,减轻I/R损伤,为治疗MI、改善病人预后提供新的思路。

3.3 坏死性凋亡与HF

HF指在各种病因的作用下,由于心肌能量代谢、兴奋收缩耦联以及心脏结构发生变化,心排血量下降,启动心率加快、心脏紧张源性加强、心肌收缩增强和心室重塑等心脏本身结构和功能、心外多种代偿机制。长期代偿导致心室重塑的发展进一步加重HF。

坏死性凋亡参与HF过程,并且促进心室重塑进程。Szobi等[30]研究发现,在HF病人的样本中,坏死性凋亡的关键介质RIP1、RIP3和MLKL及其磷酸化水平表达较健康对照组均上调,活化的Caspase-8表达显著下降,说明在HF过程中凋亡可能被抑制,促进坏死性凋亡的发生。阿霉素可以诱导心脏损伤,经阿霉素诱导的HF模型中RIP3表达上调,敲除RIP3基因可以减轻阿霉素对心脏的损害,减少MI后30 d的心功能障碍、心肌肥厚和炎症反应,提示坏死性凋亡促进慢性HF的心室重塑;在横向主动脉收缩(transverse aortic contraction,TAC)术后,小鼠在第8周出现HF,在衰竭的心脏标本中也可以观察到类似的坏死性凋亡相关蛋白上调,表明坏死性凋亡促进TAC小鼠HF发展[31]。TAC后的RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化水平表达上调可以被分子伴侣热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)90抑制剂逆转,Hsp90抑制剂也可通过抑制RIP1-RIP3-MLKL相互作用来减弱TNF-α诱导的坏死性凋亡,提示抑制Hsp90可能通过抑制受损心脏RIP1-RIP3-MLKL通路激活,从而产生治疗效果[32]。

此外,RIP1、RIP3也可以作为潜在的新治疗靶点,保护心脏免受儿茶酚胺超负荷引起的心脏损害[33]。Hippo信号效应子TEAD1[34]、硫化氢[35]通过抑制RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡成为HF的潜在治疗靶点。

3.4 坏死性凋亡与心肌炎症性疾病

坏死性凋亡可以引起严重的炎症反应,心肌炎是心脏的炎症性疾病。在病毒性心肌炎肌细胞损伤炎症反应过程中产生大量炎性因子,其中包括TNF-α,这可能与柯萨奇病毒B3诱导细胞裂解和坏死性凋亡具有一定的相似性。Zhou等[36]提出坏死性凋亡可能是急性心肌炎心肌细胞死亡的新机制。急性病毒性心肌炎小鼠模型中,Nec-1明显对小鼠心肌损伤起到保护作用[37]。

4 小 结

TNF-α介导的RIP1-RIP3-MLKL经典坏死性凋亡通路与CVD的发生发展密切相关。靶向调控这些坏死性凋亡相关的因子也为治疗CVD指明了方向。然而,目前很多研究尚在细胞模型或动物模型阶段,尚需深入研究并将这些发现转化为临床具有重要意义。