稀土元素镧对刚毛藻生理特征及抗逆性的影响*

许国静 华 华 周德柱 刘 煌 曹 琳 王图锦

(1.招商局生态环保科技有限公司,重庆 400067;2.重庆交通大学河海学院,重庆 400074)

刚毛藻(Cladophora)是一种典型的大型丝状藻,细胞结构呈分枝或不分枝的丝状体,在淡水中分布广泛。刚毛藻对营养盐的利用范围较广,例如可溶性磷质量浓度为1.1～150.0 μg/L时,刚毛藻均可生长,因此从贫营养至富营养的水体中均有刚毛藻分布[9]。刚毛藻适度生长对于消耗水中营养盐,维持水生态系统的平衡稳定起积极作用,但是过度增殖则会抑制其他水生生物的生长,产生有害物质,破坏水质,给水生态系统带来负面影响[10]。本研究以刚毛藻作为测试对象,分析镧对刚毛藻生长代谢的影响,以及镧对刚毛藻在不良环境中抗逆性的影响,以期为预测和评价镧在水生态系统的残留所造成的潜在生态影响提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

刚毛藻采自重庆市望月湖,经鉴定为寡枝刚毛藻(Cladophoraoligoclona)。刚毛藻取回后先用自来水进行清洗,去除发黄变老部分,再置于光照培养箱中,使用望月湖湖水培养7 d后开展实验,培养温度为25 ℃,光照强度为4 000 lx,光暗比为12 h∶12 h。实验用试剂均为分析纯。

1.2 La3+对刚毛藻生长及代谢的影响实验

参照HIGGINS等[11]的方法称量刚毛藻鲜质量,称量后向6个烧杯中分别放入4 g藻体,再加入1 L望月湖湖水,设置La3+质量浓度梯度分别为0.1、0.2、0.4、0.7、1.0 mg/L,另设置一组不添加La3+的对照组,每个处理设置3个平行。于光照培养箱中静置培养,培养温度为25 ℃,光照强度为4 000 lx,光暗比为12 h∶12 h,每天定时调换烧杯在培养箱中的位置,使藻体受光照均匀。定时取样测定叶绿素a(Chla)含量、光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)、可溶性糖和可溶性蛋白含量、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量。

1.3 La3+对刚毛藻抗逆性的影响实验

La3+对刚毛藻抗强光特性的影响:向5个烧杯中分别放入4 g藻体,加入1 L望月湖湖水,设置La3+质量浓度为0.2 mg/L,光照强度梯度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx,光暗比为12 h∶12 h,另设置一组不添加La3+的对照组,每个处理设置3个平行。培养温度为25 ℃,实验周期为7 d,实验结束时取样测试藻细胞Chla含量和Fv/Fm。

La3+对刚毛藻抗过氧化氢特性的影响:向6个1 L的烧杯中分别放入4 g藻体,加入1 L望月湖湖水,设置La3+质量浓度为0.2 mg/L,过氧化氢梯度为0、0.2%(质量分数,下同)、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%,另设置一组不添加La3+的对照组,每个处理设置3个平行。于光照培养箱中4 000 lx静置培养,光暗比为12 h∶12 h,培养温度为25 ℃,实验周期为7 d。实验结束时取样测试藻细胞Chla含量和Fv/Fm。

La3+对刚毛藻抗硫酸铜特性的影响:Cu2+梯度设置为0、2、4、6、8、10 mg/L。其余操作与抗过氧化氢特性的实验相同。

1.4 指标测定

将所取刚毛藻放置于两片吸水纸之间,均匀按压吸去表面水分,称量一定鲜质量的刚毛藻用于相关指标的测定。采用叶绿素荧光仪(Phyto-PAM)测定Fv/Fm;取30 mg刚毛藻,使用体积分数为90%的丙酮研磨破碎细胞后进行萃取,再采用分光光度法[12]测定Chla含量;取0.5 g刚毛藻加入5 mL生理盐水,冰浴条件下研磨10 min制成匀浆液,转移至离心管中于4 000 r/min离心10 min取上清液,再采用南京某生物工程公司的相应试剂盒测定可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量及CAT和POD活性。

2 结果与分析

2.1 La3+浓度对Chla含量的影响

Chla作为高等植物进行光合作用的主要光合色素,其含量直接反映了光合作用的强弱[13]。La3+对刚毛藻Chla的影响如图1所示,低浓度La3+处理刚毛藻对其光合色素的合成具有一定的促进作用,0.2 mg/L La3+处理7 d,刚毛藻Chla含量比初始值提高29%,显著高于对照组(P<0.05)。当使用较高质量浓度La3+(0.7、1.0 mg/L)处理后,尤其是1.0 mg/L的La3+处理后,藻体颜色发生明显变化,初始藻体呈现鲜绿色,7 d后藻体色泽褪化,出现黄化现象;Chla含量也呈现明显下降趋势。可见,La3+对刚毛藻生长的影响呈现“低促高抑”的毒物兴奋效应。低浓度稀土元素可促进植物光合色素的合成,而高浓度稀土元素则呈现出显著的重金属毒性效应,光合色素含量显著下降。

注:A0、A1、A2、A3、A5、A7分别为实验开始后0、1、2、3、5、7 d的样品编号,图2至图5同。图1 La3+对刚毛藻Chla的影响Fig.1 Effect of La3+ on Chla content of Cladophora

2.2 La3+浓度对Fv/Fm的影响

Fv/Fm是植物光系统Ⅱ光合作用性能的重要参数,是表征光合作用效率的重要指标[14]。La3+对刚毛藻Fv/Fm的影响如图2所示,低浓度La3+对刚毛藻的光合作用效率具有一定提高促进作用,当La3+质量浓度为0.2 mg/L时,培养7 d刚毛藻的Fv/Fm比初始值提高了37%,显著高于对照组(P<0.05);当使用较高质量浓度La3+(0.7、1.0 mg/L)处理后Fv/Fm明显下降。通常低浓度镧可促进植物体光系统Ⅱ蛋白复合体的活性,加快光合电子传递的速率,而高浓度镧的毒性效应则抑制了光合作用效率[15]。

图2 La3+对刚毛藻Fv/Fm的影响Fig.2 Effect of La3+ on Fv/Fm of Cladophora

2.3 La3+对可溶性糖和可溶性蛋白的影响

植物的糖代谢和光合作用密切相关,可溶性糖是光合作用的重要产物,是胞内有机物累积、储存和运输的主要形式。同时可溶性糖具有维持胞内外渗透压平衡、调控基因表达等重要功能,其含量能够反映植物对不良环境的抵抗力水平[16]。植物可溶性蛋白大多是参与新陈代谢的酶蛋白,可溶性蛋白含量是评价藻类代谢功能的重要指标[17]。本研究中La3+对刚毛藻的可溶性糖和可溶性蛋白的影响如图3所示,随La3+浓度升高,可溶性糖含量呈现先升高后下降趋势,La3+质量浓度为0.2～0.4 mg/L时,藻细胞可溶性糖含量显著高于对照组(P<0.05);La3+质量浓度为0.2 mg/L时,刚毛藻培养7 d后的可溶性糖含量比初始值提高37%,La3+浓度继续升高,可溶性糖含量呈现下降趋势。低浓度La3+的加入同样提高了刚毛藻可溶性蛋白含量,La3+为0.2 mg/L时,可溶性蛋白最高可达6.6 mg/g,比初始值提高了21%。可见,低浓度La3+对刚毛藻可溶性糖和可溶性蛋白的合成具有一定促进作用,该结论与文献报道的稀土元素对高等植物和浮游藻类的常见生物效应一致[18],这种促进作用可能与稀土元素能够刺激植物体内各种重要酶的活性,协调植物对营养元素的吸收,促进钙调蛋白编码基因的表达等因素有关[19-20]。

图3 La3+对刚毛藻可溶性糖和可溶性蛋白的影响Fig.3 Effect of La3+ on soluble sugar and soluble protein content of Cladophora

2.4 La3+对CAT和POD活性的影响

CAT和POD是植物胞内的抗氧化酶,是清除胞内活性氧的重要成分,然而当植物受到严重胁迫时,抗氧化酶活性受到抑制,导致活性氧无法及时被清除,对植物细胞的生理功能造成危害甚至导致死亡[21]。因此,CAT和POD活性被用于反映植物抵抗逆境的能力。分析添加La3+对刚毛藻CAT和POD活性的影响,结果如图4所示,0.1～0.4 mg/L La3+提高了CAT和POD活性。La3+质量浓度为0.2 mg/L时,刚毛藻培养7 d后CAT和POD活性分别为23.35、43.67 U/g,比初始值分别提高94%和78%。1.0 mg/L的La3+对CAT和POD活性均具有抑制效应,7 d后CAT和POD活性比初始值分别降低73%和54%。

图4 La3+对刚毛藻CAT和POD活性的影响Fig.4 Effect of La3+ on CAT and POD activities of Cladophora

2.5 La3+对MDA的影响

MDA是植物细胞膜脂过氧化反应过程中一种重要产物,其含量高低表明过氧化程度,MDA常被用作反映植物体生理状况和衰老的指标,通过测定MDA含量可评判细胞膜受损伤程度及受胁迫程度[22]。如图5所示,0.1～0.2 mg/L的低质量浓度La3+处理后MDA含量随培养时间延长有所降低,La3+质量浓度为0.2 mg/L时,刚毛藻培养7 d后MDA含量下降27%。1.0 mg/L La3+处理时MDA含量相比对照组显著升高(P<0.05),培养7 d后MDA含量是对照组的2.4倍。结果表明,低浓度La3+能够通过提高抗氧化酶活性,从而抑制了膜脂过氧化反应,MDA含量降低,细胞抗逆性得到增强;而高浓度La3+处理刚毛藻时,由于抗氧化酶活性降低,细胞膜脂过氧化作用加强,产生并积累了大量MDA,细胞膜脂过氧化作用对细胞正常生理功能将造成一定损伤,藻细胞抗逆能力减弱。

图5 La3+对刚毛藻MDA的影响Fig.5 Effect of La3+ on MDA content of Cladophora

2.6 生理指标相关性分析

对0.2 mg/L La3+处理下刚毛藻的各项生理指标进行相关性分析,结果见表1。Fv/Fm、Chla含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性这些指标两两之间呈现不同程度的显著正相关关系,MDA含量与其余指标大体呈现显著负相关关系(P<0.05)。可见,0.2 mg/L La3+对于藻细胞新陈代谢有着重要的积极影响,且各项生理指标的变化趋势密切关联。0.2 mg/L La3+作用下,藻细胞抗逆性提升,受损状况减弱,有利于光合作用效率、蛋白质和糖的合成代谢功能提升。

表1 各生理指标相关性1)Table 1 Correlation of physiological indexes

2.7 La3+作用下刚毛藻抗逆性变化特征

光照强度是刚毛藻光合作用效率及光合色素合成的重要影响因素之一,对刚毛藻吸收氮、磷营养盐的性能关系密切,刚毛藻对强光照敏感,强光照通常会对刚毛藻的生长代谢产生抑制作用,造成藻体黄化及机体功能的退化[23]。添加0.2 mg/L La3+对刚毛藻抗强光特性的影响如图6所示,不同光照强度下,刚毛藻Chla含量和光合作用效率呈现差异。其中,在2 000～4 000 lx光照强度内,对照组刚毛藻的Chla含量和光合作用效率整体较为稳定,藻体呈鲜绿色。而在光照强度高于4 000 lx时,Chla含量和光合作用效率随光照强度的增强出现大幅下降,尤其是在10 000 lx强光照下,对照组Chla含量和Fv/Fm相比2 000 lx光照下分别降低39%和32%,藻体偏黄绿色。而添加La3+处理组中,不同光照强度下刚毛藻Chla含量和光合作用效率整体较为稳定,即使在10 000 lx强光照下,Chla含量和Fv/Fm相比2 000 lx光照下分别降低22%和17%,Chla含量和Fv/Fm整体显著高于对照组(P<0.05),藻体维持鲜绿色。可见添加0.2 mg/L La3+能够显著增强刚毛藻对强光的抗性。

图6 La3+对强光照胁迫下刚毛藻Chla和Fv/Fm的影响Fig.6 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under strong light stress

过氧化氢是一种环境友好型杀藻剂,在水环境中过氧化氢产生的羟基自由基(·OH)具有强氧化性,与藻细胞接触能够氧化细胞膜脂、蛋白分子及光合色素等,从而杀伤藻细胞[24]。La3+对刚毛藻抗过氧化氢氧化特性的影响如图7所示,过氧化氢处理 7 d,各浓度下对照组刚毛藻的生长均表现出抑制效应,且过氧化氢浓度越高,抑制作用越明显;1.0%过氧化氢处理7 d对刚毛藻的抑制率最高,Chla含量和Fv/Fm相比未添加过氧化氢时分别降低72%和81%。0.2 mg/L La3+能够明显提高刚毛藻对过氧化氢的抗性,缓解过氧化氢对刚毛藻的杀伤作用,Chla含量和Fv/Fm相对稳定。添加La3+能够显著提高CAT和POD这两种抗氧化酶活性,从而迅速清除过氧化氢,降低过氧化氢对细胞的氧化破坏作用,从而提高了刚毛藻对过氧化氢的抗性。

图7 La3+对过氧化氢胁迫下刚毛藻Chla和Fv/Fm的影响Fig.7 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under hydrogen peroxide stress

Cu2+对细胞生长代谢具有强烈的抑制作用,其作用机理复杂,通常对细胞质膜的转运功能、光合作用、核酸代谢、碳氢化合物代谢以及光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的电子传递途径均有着强烈的干扰效应,因此硫酸铜常被用作杀藻剂以控制水中藻类的过度生长[25]。Cu2+对刚毛藻的影响如图8所示,2 mg/L Cu2+对对照组刚毛藻的生长具有一定的促生作用,而更高浓度的Cu2+对刚毛藻的Chla含量和光合作用效率均表现出抑制效应,且Cu2+浓度越高,抑制效果越明显;10 mg/L Cu2+处理对刚毛藻的抑制率最高,Chla含量和Fv/Fm相比未添加硫酸铜时分别下降63%和69%。添加0.2 mg/L La3+条件下,2 mg/L Cu2+处理组对刚毛藻的生长仍旧具有一定的促生作用,而更高浓度的Cu2+呈现的抑制效应也强于对照组。可见,添加La3+未能提高刚毛藻对高浓度Cu2+的抗性,甚至产生更强的抑制作用,这可能与La3+与Cu2+叠加的重金属毒性效应以及Cu2+复杂的抑制机制有关。

图8 La3+对硫酸铜胁迫下刚毛藻Chla和Fv/Fm的影响Fig.8 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under copper sulfate stress

3 结 论

(1) La3+对刚毛藻生长的影响呈现低浓度促进高浓度抑制的毒物兴奋效应。采用0.2 mg/L的低质量浓度La3+处理刚毛藻7 d,刚毛藻的Chla含量、Fv/Fm、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性比初始值分别提高29%、37%、37%、21%、94%和78%,MDA下降27%。

(2) 0.2 mg/L La3+处理后刚毛藻各项生理指标的变化具有联动性,Fv/Fm、Chla含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性之间呈不同程度的显著正相关关系,上述指标与MDA含量大体呈显著负相关关系(P<0.05)。

(3) 不同逆境下低浓度La3+对刚毛藻的抗逆性具有差异化影响,0.2 mg/L La3+能够明显增强刚毛藻对强光照(6 000～10 000 lx)和过氧化氢(0.2%～1.0%)的抗性,而在高质量浓度Cu2+(4～10 mg/L)下,0.2 mg/L的La3+导致刚毛藻所受到的损伤增强。