圈养孟加拉虎脂肪间充质干细胞的分离培养和生物学特性

冼伟杭，张天佑，赖健仪，王丙云，董贵信，3，陈志胜，陈胜锋，白银山，刘璨颖，张 晖，计慧琴

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山，528200；2.广东长隆集团有限公司，广州，511430；3.广东华南珍稀野生动物物种保护中心，珠海，519031）

孟加拉虎（Panthera tigris tigris）是一种珍稀野生动物，保护这一珍稀动物除恢复栖息地外，还可通过圈养维持物种数量。目前圈养的孟加拉虎常发肾炎［1］，常规治疗方法是使用抗菌消炎药物以及调节电解质和水盐平衡，但并不能修复受损器官组织结构，即不能完全恢复肾脏功能，可能导致孟加拉虎死亡。因此，为保护孟加拉虎，需要找到一种新型且有效地用于孟加拉虎肾炎治疗的方法。在这种情况下，一种涉及间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的疗法——再生疗法逐渐进入人们的视野。从中胚层起源的干细胞称为间充质干细胞，具备自我更新和多向分化潜能［2-4］。脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）来源于脂肪，大量研究发现其在肾损伤治疗上具有疗效［5-12］，并且具有来源丰富、操作简便、容易获取、体外增殖能力强等特征［13-15］，目前已经从人、马、猪和牛等物种中成功分离［16-23］。ADMSCs 能通过分化途径分化为受损组织细胞［5，7-10］及通过旁分泌途径分泌因子发挥干细胞募集、血管再生、减轻炎症反应和抗细胞凋亡等作用［5-10，12］，促进受损组织的修复，进而起到有效治疗肾损伤的效果［5-12］。

基于AD-MSCs 在治疗肾损伤方面的作用，认为其具备治疗虎肾病的潜能，但目前缺乏标准化的分离、培养和鉴定虎AD-MSCs 的方法。本试验拟研究虎AD-MSCs 的分离方法、培养体系以及生物学特性，为虎的肾病等疾病治疗提供种子细胞。

1 材料与方法

1.1 实验动物

长隆野生动物园1岁雌性孟加拉虎。

1.2 脂肪采集及原代AD-MSCs的分离和培养

对孟加拉虎进行腹部增生物切除手术时，在距离患处5 cm 处采集脂肪，然后结节缝合，将采集到的脂肪储存在含有10%双抗的1×phosphate buffered saline（PBS）中，冷藏保存运输到实验室。用含10%双抗的PBS 洗去组织上的血液，清洗干净后将组织放进50 mL 离心管中，用无菌器械将组织剪碎，加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化1 h 至无明显组织块后终止消化；将消化好的组织过滤并离心，弃上清，用完全培养基将细胞重悬；进行细胞计数，然后将细胞密度调整到1×106个/mL 并转移到培养皿中，放置于培养箱37 ℃、5% CO2培养，24 h 后观察细胞贴壁情况。

1.3 细胞传代培养、生长特性观察及生长曲线的绘制

待细胞在培养皿生长面积达到80%，吸去上清，用PBS 清洗。加入胰酶消化，40 s 后加入终止液终止消化。离心弃上清，传代扩增培养。显微镜下观察细胞生长状态和活性，拍照记录。依次选取P3、P6、P9 代孟加拉虎AD-MSCs，调整细胞密度并接种于96 孔板，培养24 h 后，每天同一时间段选取5 孔，加入CCK8 孵育30 min，利用酶标仪测量并记录对应OD 值，每孔测量3 次取平均值，持续8 d。以横坐标为培养时间，纵坐标为OD 值绘制生长曲线。

1.4 细胞形态学观察

使用倒置显微镜对原代及传代细胞的形态进行观察并记录。

1.5 AD-MSCs成脂诱导分化试验

选取生长状态良好的P3 代细胞，调整细胞密度接种到24 孔板中培养，各选取3 个孔作为对照组和试验组。对照组用完全培养基培养，试验组加入诱导分化A 液，诱导分化A 液由88.5%基础培养基、10.0%胎牛血清、1.4%成脂诱导分化添加物A-Ⅰ和0.1%成脂诱导分化添加物A-Ⅱ构成。培养3 d后加入B 液培养1 d 为1 个循环，诱导分化B 液由90.0%基础培养基、9.8%胎牛血清和成脂诱导分化添加物B构成。试验组在培养3个循环后，弃上清，清洗，用多聚甲醛固定30 min，弃去多聚甲醛并清洗。用油红O 染色30 min，染色结束清洗多余染液，利用倒置显微镜观察并拍照记录。

1.6 AD-MSCs成骨诱导分化试验

选取生长状态良好的P3 代细胞，调整细胞密度接种到24 孔板中培养，各选取3 个孔作为对照组和试验组。对照组用完全培养基培养，试验组用成骨诱导分化培养基培养，培养14～21 d可见细胞表面有明显粗糙样物质，弃上清并清洗细胞，用多聚甲醛固定30 min，弃多聚甲醛并清洗，加入茜素红染液染色30 min，染色结束清洗多余染液置于倒置显微镜下观察并拍照记录。

1.7 总RNA提取及cDNA合成

将虎AD-MSCs 接种于6 孔板上，待细胞长满弃上清并用DEPC-H2O 清洗，然后按照以下步骤进行：（1）用TRIzol 液裂解细胞后离心。（2）离心结束弃上清加入氯仿，混合静置离心。（3）离心结束吸取上层水层至新的EP 管中，加入异丙醇混合离心。（4）离心结束后弃上清，加入乙醇，混合离心。（5）离心结束弃上清，沉淀室温干燥后加入RNase-free ddH2O溶解沉淀并检测浓度，结果显示A260/A280值为1.867，可用于cDNA 合成。（6）cDNA 合成使用TaKaRa 反转录试剂盒，依据试剂盒说明书操作，-20 ℃保存合成的cDNA。

1.8 PCR基因检测

将cDNA 全组基因作为模板进行PCR 体系扩增，电泳检测扩增产物，引物设计见表1。因产物大小在200～3 000 bp，所以需配制1.5% 的电泳胶，取0.75 g 琼脂粉加热溶解在60 mL 的1×TAE 缓冲液中，然后加入4 µL 核酸染液搅拌均匀，倒板并冷却30 min，冷却后依次加入DL2000 DNA Marker及PCR 产物，在电压120 V、电流200 mA 的条件下电泳20 min，电泳结束后在照胶仪下观察记录电泳结果。

表1 MSCs相关基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of MSCs related genes

2 结果

2.1 细胞形态学观察

通过Ⅰ型胶原酶消化法得到原代培养的细胞呈圆形，部分贴壁细胞呈梭状，胞体透亮（图1A）；培养48 h 后，大量细胞开始贴壁，细胞形态为长梭形，胞质较大，折光性强（图1B）；培养72 h 后，细胞生长面积为70%～80%，可进行传代扩增培养（图1C）；传代细胞形态为均匀梭形（图1D）；传代培养至P6代细胞生长稳定（图1E）；细胞形态没有发生改变（图1F）。

图1 孟加拉虎AD-MSCs生长状况Fig.1 Growth of AD-MSCs in Bengal tiger

2.2 AD-MSCs生长曲线

图2显示，P3、P6和P9代虎AD-MSCs的生长曲线均为S型，P3、P6和P9培养至第4天进入对数生长期，P3、P6代细胞培养至第7天进入平台期，P9代细胞培养至第8天进入平台期。与P3、P6代细胞比，P9代细胞增殖能力下降。符合MSCs生长曲线规律。

图2 孟加拉虎AD-MSCs生长曲线Fig.2 Growth curve of AD-MSCs of Bengal tiger

2.3 AD-MSCs成脂诱导分化

取生长状态良好的P3 代细胞进行成脂诱导分化，对照组细胞形态上没有明显变化，试验组细胞在加入诱导分化培养基4 d 后，胞体变大变圆，部分细胞发生融合，且可见胞质内出现大小不一的脂质颗粒，培养6 d 后脂滴增多变大。培养8 d，脂滴明显，用油红O 染色结果显示试验组的脂滴能红染（图3B），对照组不被染色（图3A），表明虎AD-MSCs具有脂向分化能力。

图3 孟加拉虎AD-MSCs成脂诱导分化结果（100×）Fig.3 Adipogenic differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.4 AD-MSCs成骨诱导分化

取生长状态良好的P3 代细胞进行成骨诱导分化鉴定，对照组细胞形态上没有发生明显变化。试验组加入成骨诱导培养液培养7 d后，细胞形态发生明显变化，由长梭状变为鳞片状，细胞成片状堆积；诱导培养14 d 细胞表面可见粗糙样物质，此时利用茜素红进行成骨染色。显微镜下观察试验组可见细胞融合生长，视野内可见明显红染区域（图4B），表明成骨诱导条件下细胞形成钙结节。对照组视野下无明显红染区域（图4A）。

图4 孟加拉虎AD-MSCs成骨诱导分化结果（100×）Fig.4 Bone induced differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.5 AD-MSCs表面标记物基因检测

PCR 基因检测结果如图5 所示，表面标记物CD90、CD105、CD29 和CD44 在相应范围有明显条带，CD34 在相应范围无条带，表明该细胞阳性表达CD90、CD105、CD29 和CD44，不表达CD34，结果符合间充质干细胞表面标记物特性。

图5 孟加拉虎AD-MSCs表面标记物基因检测结果Fig.5 Detection results of AD-MSCs surface marker genes in Bengal tiger

3 讨论

圈养孟加拉虎常发肾炎疾病［1］，恢复受损组织的再生疗法成为新的治疗选择。再生疗法是以MSCs 为基础的治疗方式［24］。MSCs 是一种起源于中胚层的干细胞，具有自我更新能力和多向分化能力［2-4］，在体外培养能连续传代且保持细胞的形态和特性。诱导培养条件下，能分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等多种细胞。MSCs 具有免疫原性低、趋化归巢、旁分泌和免疫调节等能力［2-3］，因此广泛应用于再生医学的研究。AD-MSCs 与其他来源的MSCs 相比，具有来源丰富、供体创伤轻、易获得和体外增殖能力强的特点［13-15］。目前已经成功从多种动物上分离培养AD-MSCs，但虎脂肪来源的MSCs分离培养没有研究报道。在多种疾病的治疗上，ADMSCs被大量使用，其中在肾损伤治疗的研究中也取得进展，如犬、猫及小鼠的急性肾损伤、缺血性灌注肾损伤模型的治疗中具备效果［5-12］。不同种属的同种MSCs能表达相同表面标记物，相同表面标记物表达表明细胞具有相似的潜能［25-26］，因此虎AD-MSCs的分离方法、培养体系的建立具有重要意义，为后续虎AD-MSCs 的应用建立基础，为虎肾病的治疗提供新式疗法。

AD-MSCs分离方法主要为胶原酶消化法。本研究采取Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织分离得到虎的AD-MSCs。在显微镜下可见细胞形态为长梭形，生长方式为旋涡状生长，与已有研究［16-23］分离的ADMSCs 形态描述结果相符。对细胞进行多次传代培养，细胞形态保持不变，均为长梭形，P3、P6 和P9 细胞生长曲线符合MSCs 生长曲线规律。P3、P6 代细胞增殖能力差异小，与P3、P6代细胞比，P9代细胞增殖能力下降。有研究表明，MSCs 在体外培养条件下，P3 至P6 MSCs 增殖速度快、形态良好、活性强。MSCs传代至P9后，MSCs会出现空泡化、胞体变大及增殖缓慢等细胞老化现象［27］。根据MSCs 体外培养的特点可以为后续临床应用细胞代数的选择提供参考，同时也要求完善体外培养体系，延缓细胞老化。

本研究使用PCR 检测AD-MSCs 表面标志物，通过PCR 扩增得到相应MSCs 特定表面标记物基因片段。结果显示在区间范围内有CD90、CD44、CD105及CD29条带，无CD34条带。在诱导培养基条件下，AD-MSCs 可向脂肪、骨和软骨等方向分化。本试验分别对孟加拉虎AD-MSCs 进行成骨和成脂诱导分化，检测虎AD-MSCs 的多向分化能力。成骨诱导培养基主要成分为地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，其中地塞米松和抗坏血酸有利于骨成熟和细胞外基质胶原的合成，而β-甘油磷酸钠有利于细胞内钙盐沉积和钙化形成。沉积的钙盐可用茜素红染液染成深红色以便在显微镜下观察。成脂诱导分化液中主要诱导因子有胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松，能够促进MSCs 向脂肪方向诱导分化。上述结果均符合国际MSCs 标准定义，即：表达CD44、CD90、CD105和CD29等MSCs表面标记物，不表达CD34等造血细胞表面标志物；在特定条件下可诱导分化为骨细胞和脂肪细胞［16-23，28-29］。

本研究不提供细胞流式鉴定结果，原因是目前可以获取的流式抗体因种属特异性，无法在虎ADMSCs 上表达，不适用于虎AD-MSCs 的流式细胞术鉴定。

综上所述，本研究成功建立虎AD-MSCs 原代分离培养方法，该方法操作简单方便，具有获得大量虎AD-MSCs的优势，同时通过诱导分化、表面标记物表达等鉴定试验，表明所获取细胞为虎AD-MSCs，为虎AD-MSCs的后续研究和临床应用提供稳定的细胞分离和培养方法。