姜黄素经内质网应激对缺血再灌注损伤大鼠心肌凋亡的保护作用及机制研究

曾石秀，陈 艳，韩巧秀，刘贱丰，王 丽，钟一鸣

（1. 赣南医学院第一附属医院心内科；2. 赣州市会昌县中医院内二科；3. 赣南医学院第一附属医院病理科；4. 赣南医学院第一附属医院检验科；5. 赣南医学院第一附属医院信息科，江西 赣州 341000）

目前我国心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，心血管疾病死亡人数位居城乡居民总死亡首位［1］。心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury，I/R）是缺血性心血管病患者在接受早期溶栓、冠状动脉旁路移植术或经皮冠状动脉介入治疗等再灌注治疗时，导致心肌进一步损伤的一种常见的临床症状［2-3］，是再灌注治疗后早期死亡的重要原因。姜黄素（Curcumin）是从姜黄（姜科）根部提取出来的一种自然产生的化合物。姜黄是姜科植物，其根茎可入药，气香特异，味苦、辛，性温，归脾、肝经；具有破血行气、通经止痛功能，用于胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛的治疗［4-5］。姜黄素具有多种药理活性，目前已被证明可有效治疗慢性炎症性疾病、癌症、神经退行性疾病、关节炎和心血管疾病［6-7］。本研究建立急性心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，研究姜黄素在大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的保护作用机制，即能否通过减轻内质网应激（Endoplasmic reticulum stress， ERS）发挥其抗I/R 作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物健康SPF 级雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠50 只，体重200～250 g，由湖南斯莱克景达实验有限公司提供［合格证号SCXK（湘）2019-0004］。

1.1.2 药品与试剂姜黄素购自Sigma公司，TUNEL试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，GRP78、Caspase-12、CHOP、GAPDH 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.1.3 仪器荧光显微镜（Zeiss，德国），全自动脱水机（Leica，德国），石蜡包埋机（Leica，德国），切片机（Leica，德国），连续光谱多功能酶标仪（Thermo Fisher，美国），超微量紫外分光光度计（Thermo Fisher，美国），荧光定量PCR（Bio-Rad，美国），蛋白质电泳转印系统（Bio-Rad，美国），化学发光凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组、给药建模雄性SD 大鼠50 只，5只1 笼，饲养在恒温（22±2）℃、恒湿（55±5）%、人工光照明暗各12 h 的饲养室内，标准饲料和自来水随机取食。将大鼠适应性饲养1 周后，随机分为5 组，每组10 只，并接受相应的处理：①假手术组（sham组）：先给予生理盐水10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再行假手术。②缺血再灌注组（I/R组）：先给予生理盐水10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。③姜黄素［10 mg·（kg·d）-1］+I/R 组（Cur-L 组）：先姜黄素10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。④姜黄素［20 mg·（kg·d）-1］+I/R 组（Cur-M 组）：先姜黄素20 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。⑤姜黄素［30 mg·（kg·d）-1］+I/R 组（Cur-H组）：先姜黄素30 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。

1.2.2 动物模型制备假手术方法：左侧开胸，左冠状动脉前降支下穿线不结扎。根据WU Y W 等［8］方法构建缺血再灌注损伤大鼠模型：术前12 h 大鼠禁食不禁饮，腹腔注射2%戊巴比妥钠（3 mL·kg-1）麻醉大鼠，仰卧位固定，小白线拴牙固定头部。沿胸骨柄左侧向剑突方向备出一长约3 cm 宽约1.5 cm的皮肤区域，然后用碘伏消毒。经口腔插入气管插管，插管时需拉住舌尖将气管插管一端抵至咽喉处，看到有潮湿气体进入插管后再向内推入0.5 cm即可。气管插管放置妥当后缝合固定。将电极金属夹夹持1寸针灸针刺入大鼠四肢皮下，连接BL-420S生物医学记录系统记录Ⅱ、Ⅵ心电图，观察大鼠心电图变化。设置动物呼吸机的呼吸比为1∶1，呼吸频率为85～90 次·min-1，潮气量为6～12 mL/次，然后将呼吸机气管与气管插管连接。开启呼吸机，胸骨柄正中位切口，逐层分离暴露心包，分离心包使心脏暴露。使用7-0 的丝线在左前降支下穿线，以结扎血管供血区域心脏的颜色由红转白表明心肌缺血成功。缺血30 min 后剪断结扎线，恢复血流灌注2 h。

1.2.3 样本制备于实验第21 d 行手术，手术成功后从颈静脉取血后立即处死大鼠，迅速取心脏放于PBS溶液中清洗干净，再用过滤纸吸干表面液体，保持标本干净，部分组织放入4%多聚甲醛溶液固定；余心脏组织置于液氮中保存。

1.2.4 心肌细胞凋亡的检测用4%的多聚甲醛固定心肌组织样本24 h 后石蜡包埋。按照TUNEL凋亡试剂盒的步骤染色。在荧光显微镜高倍镜下（400 倍）随机选取3 个视野观察并计数TUNEL 阳性细胞数目及总细胞数，计算心肌细胞凋亡指数。凋亡指数（AI）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 检测血清心肌酶的水平大鼠颈静脉采血，室温静置20 min，随后3 000 r·min-1离心15 min；取血清，分装后保存-80 ℃。血清心肌酶含量检测按肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-MB， CK-MB）ELISA 试剂盒说明书进行操作，然后于酶标仪上检测CK-MB 的吸光度值（A450 nm），最后根据标准曲线换算出各组的血清心肌酶含量。

1.2.6 RT-qPCR 检测相关mRNA 的表达Trizol法抽提总RNA，并测定总RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再按照荧光定量PCR 试剂盒说明书进行cDNA 扩增。引物序列见如下：GRP78 F：5'-AGGAGGACAAGAAGGAGGA-3'，R：5'-GAGTGAAGGCCACATACGA-3'；CHOP F：5'-CTTGACCCTGCATCCCT-3'，R：5'-CCTCTTCTTCC TCCTGAGC-3'；Caspase-12 F：5'-ATTGTGAGAGCCA CCCCTTC-3'，R：5'-TGGGGAACCACCAGACCTTA-3'；GAPDH F：5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3'，R：5'-ACACCGACCTTCACCATCT-3'。荧光定量PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s 并收集荧光，共40 个循环；并做溶解曲线（60～94 ℃）。数据采用相对定量法，以2-△△Ct来进行分析，△Ct=Ct 目的-Ct 内参，△△Ct=△Ct 实验组-△Ct对照组。

1.2.7 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白质的表达取少量心肌组织块置于1～2 mL匀浆器中尽量粉碎，加400 mL 单去污剂裂解液裂解匀浆；置于冰上重复碾碎；裂解30 min 后，将裂解液移至1.5 mL 离心管中，12 000 r·min-1离心20 min，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，10% SDS-PAGE 凝胶电泳，湿式电转移法将蛋白条带转移至PVDF 膜，室温封闭2 h后加入GRP78、CHOP、Caspase-12一抗（1∶1 000）及兔抗GAPDH抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗膜3 次，每次10 min。然后分别加入山羊抗兔IgG（1∶10 000）室温孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。用化学发光液显影蛋白条带，使用Image Lab软件分析目标蛋白（GRP78、CHOP 和Caspase-12）和内参照GAPDH 的灰度值，以各目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值的比值分别反映各目的蛋白的相对表达。

1.3 统计学方法数据均采用SPSS 18.0 统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD 或Dunnett T3 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞凋亡比较假手术（sham）组大鼠心肌组织无明显细胞凋亡，与sham 组比较，I/R 组及Cur-L 组、Cur-M 组、Cur-H 组可见明显的凋亡细胞，凋亡指数增加（P＜0.01）；与I/R 组比较，Cur-L组、Cur-M组、Cur-H组凋亡细胞减少，凋亡指数降低（P＜0.01），其中，Cur-H 组的凋亡指数最小（P＜0.01）（图1、图2）。

图1 TUNEL染色荧光镜下各组心肌细胞凋亡情况比较（×400）

图2 各组大鼠心肌组织细胞凋亡指数比较

2.2 各组血清心肌酶水平比较与sham 组比较，I/R 组及Cur-L 组、Cur-M 组、Cur-H 组大鼠血清中CK-MB 显著升高（P＜0.001）；与I/R 组比较，Cur-L组、Cur-M 组、Cur-H 组大鼠血清中CK-MB 显著降低（P＜0.001）；与Cur-L 组比较，Cur-M 组、Cur-H 组血清CK-MB显著降低（P＜0.001）（表1）。

表1 各组大鼠血清CK-MB水平比较/

表1 各组大鼠血清CK-MB水平比较/

注：与sham组比较①P＜0.001；与I/R组比较②P＜0.001；与Cur-L组比较③P＜0.001。

?

2.3 各组GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA 比较与sham 组比较，I/R 组及Cur-L 组、Cur-M 组、Cur-H 组GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA 表达增加（P＜0.05）；与I/R 组比较，Cur-L 组、Cur-M 组、Cur-H组GRP78 mRNA表达增加，CHOP、Caspase-12 mRNA表达降低（P＜0.05）；与Cur-L 组比较，Cur-M 组GRP78 mRNA 表达增加，CHOP、Caspase-12 mRNA表达降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各组GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA表达比较/

表2 各组GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA表达比较/

注：与sham组比较①P＜0.01，②P＜0.001；与I/R组比较③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001；与Cur-L组比较⑥P＜0.05。

?

2.4 各组GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白比较与sham组比较，I/R组及Cur-L组、Cur-M组、Cur-H组GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表达增加（P＜0.05）；与I/R 组比较，Cur-L 组、Cur-M 组、Cur-H 组GRP78 蛋白表达增加，CHOP、Caspase-12 蛋白表达降低（P＜0.05）；与Cur-L 组比较，Cur-M 组GRP78蛋白表达增加，CHOP、Caspase-12 蛋白表达降低（P＜0.05）（表3）。

表3 各组GRP78、CHOP 和Caspase-12蛋白表达比较/

表3 各组GRP78、CHOP 和Caspase-12蛋白表达比较/

注：与sham组比较①P＜0.05，②P＜0.001；与I/R组比较③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001；与Cur-L组比较⑥P＜0.05。

?

3 讨论

目前，已从姜黄中鉴定出200 多种活性成分［9］，姜黄素安全性高，在治疗上表现出多种生物效应，如抗炎［10］、降糖［11］、抗氧化［12-13］、免疫调节［14-15］、抗凝［16］、降脂［17］、保肝［18-19］和抗抑郁［20-21］等。越来越多的证据表明姜黄素在心脏缺血再灌注损伤中具有心脏保护作用［22-23］，了解这种保护作用可能有助于深入了解心肌损伤的机制。内质网（Endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞重要的细胞器，弥散分布在整个胞质区域，在细胞蛋白和脂质合成、钙信号调控等过程中发挥了重要作用［24-25］。众多的病理性细胞刺激往往会引发未折叠蛋白和错误折叠蛋白在胞内累积，从而引起内质网应激（Endoplasmic reticulum stress， ERS）［25-26］。适当的ERS 有利于激活细胞保护性适应机制，但一旦ERS 持续时间过长或过强，会使内质网稳态失衡，则引起细胞凋亡［27］。ERS 诱导的凋亡存在多种途径，包括CHOP 通路、Caspase-12活化、JNK 通路、Bcl-2蛋白家族和钙超载等［28］。ZHANG C 等［29］研究显示在I/R 模型中，未折叠蛋白反应被激活，且下游的PERK、IRE1、ATF6 信号通路也均被激活。在缺血性心脏病的发展过程中ERS 参与了重要的病理机制，抑制ERS 可能对I/R损伤的心肌有益［30-31］。

本实验结扎大鼠前降支成功构建缺血再灌注损伤模型，为接下来实验干预研究提供了稳定的动物模型。血清中CK-MB 升高和心肌细胞凋亡程度是I/R 的主要特征之一，可以反映心肌受损程度，心肌细胞损伤CK-MB 水平升高。研究结果显示，姜黄素能显著降低CK-MB 水平，说明使用姜黄素可以改善心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡。细胞凋亡的分子调控机制复杂，其中，ERS 诱导葡萄糖调节蛋白（Glucose-regulated protein，GRP78）表达而产生保护作用，正常状态下GRP78 与蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase， PERK）结合，ERS 发生时，GRP78 与 PERK 解离，PERK 磷酸化并诱导CHOP表达［32］。CHOP 蛋白是ERS 性凋亡的重要蛋白，门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12（Cysteine aspartic acid specific protease-12， Caspase-12）是内质网特异性的凋亡效应蛋白，其可通过切割Bid 蛋白，促使活性的p15 Bid 蛋白释放和堆积，激活凋亡执行因子Caspase-3，从而抑制或活化Bax、Bcl-2 等凋亡相关蛋白表达，诱导细胞凋亡［33］。本研究结果也显示，与假手术组比较，模型组GRP78、CHOP、Caspase-12表达增加，与模型组比较，使用姜黄素的大鼠心肌细胞CHOP、Caspase-12 表达降低，其作用机制与增加GRP78 表达，抑制CHOP、Caspase-12 表达有关，初步显示姜黄素可能通过抑制ERS 介导的细胞凋亡而改善大鼠I/R。然而，姜黄素减轻I/R 可能涉及多种作用机制，本实验的局限性是仅聚焦在ERS 介导的细胞凋亡，未能从多方面去探讨姜黄素的可能机制。

综上表明，姜黄素对缺血再灌注损伤的心肌细胞有一定的保护作用，其机制可能与其抑制ERS 触发的GRP78/Caspase-12 信号通路活化有关。本研究为解释缺血再灌注损伤的发病机制提供了新的思路，也进一步验证了姜黄素对缺血再灌注损伤的心肌细胞治疗作用。此外，抑制GRP78/Caspase-12通路激活也有望成为临床治疗缺血再灌注损伤的新策略及药物研发的新思路。