萝卜SCPL3 基因的克隆与生物信息学分析

李紫薇，霍燕琦，徐铭婕，张文静，刘同金

（金陵科技学院园艺园林学院，南京 210000）

丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases，SCP）是一类真核生物水解酶，主要存在于真菌或植物的液泡以及动物的溶酶体中［1］。丝氨酸羧肽酶类蛋白（Serine carboxypeptidase-like proteins，SCPL）是与SCP 在结构和功能上高度相似的一类蛋白，二者同属于SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族［2］。S10 蛋白家族是催化功能蛋白成熟的庞大蛋白水解酶家族，可分为溶酶体Pro-Xaa 羧肽酶、丝氨酸D-Ala-D-Ala羧肽酶、羧肽酶C、羧肽酶D 四大类酶，植物中的SCP/SCPL 蛋白基本都属于羧肽酶C 和羧肽酶D［3］。根据氨基酸序列特征，SCP/SCPL蛋白可分为羧肽酶Ⅰ、羧肽酶Ⅱ、羧肽酶Ⅲ三大类［4］，动植物中的SCPL 蛋白多属于羧肽酶Ⅰ和羧肽酶Ⅱ，而羧肽酶Ⅲ主要存在于植物、酵母和丝状真菌中［5］。此外，有些SCPLs 除了具有肽酶活性外，还具有酰基转移酶活性［6］。

结构上，SCP/SCPL 蛋白均含有高度保守的“α/β水解酶折叠”三级结构以及独特的拓扑结构催化中心［7］，存在1 个与底物结合的保守结构域和3 个催化作用的保守结构域，含有多个N-糖基化位点，1 个细胞内分泌和转运信号肽［5］。功能上，SCP/SCPL 蛋白参与调控植物多种生理过程，主要涉及种子萌发过程中储存蛋白的水解反应［8］、植物创伤应答反应［9］、油菜素内酯信号转导途径［10］、细胞程序性死亡时胞内组分的自溶［11］、植物次生代谢物的酰基化修饰及对逆境的响应［12］。

萝卜（Raphanus sativusL.）为一年或二年生十字花科草本植物，是世界重要的蔬菜作物，具有较高的经济、药用和食用等价值。但在萝卜的生长发育过程中经常遭受多种生物和非生物胁迫，严重影响其产量与品质。发掘萝卜抗逆性相关基因，不仅能揭示其抗性分子机制，也能加快萝卜抗性育种进程。SCPL 蛋白在调控高等植物的多种生理过程中发挥重要作用，但萝卜SCPL基因的功能和表达调控研究鲜见报道。本研究通过RT-PCR 技术克隆了萝卜SCPL3（RsSCPL3）基因CDS 全长序列，并对其进行生物信息学分析，旨在为进一步开展该基因的功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 心里美萝卜高代自交系CCHX17-6。

1.1.2 供试试剂 RNA 提取试剂盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit、DL2000 Plus DNA Marker（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），反转录试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（北京宝日医生物技术有限公司），KOD-Plus-Neo 高保真酶［东洋纺（上海）生物技术有限公司］，pENTR™/D-TOPO®cloning kit（Invitrogen），琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（天根生化科技有限公司），琼脂糖、50×TAE 缓冲液、硫酸卡那霉素、琼脂粉、LB 培养基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，GelRed 核酸染料（Biosharp），DH5α 大肠杆菌化学感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器 MIKRO220R 型高速冷冻离心机（德国Hettich 公司），S1000TM型PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司），DYY-2C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司），GenoSens1880 型凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司），DW-86L286 型超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司产品），SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏州净化设备有限公司），HVA-85 型高压灭菌锅（日本HIRAYAMA 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成将萝卜自交系CCHX17-6 种植于金陵科技学院园艺实验站，取成熟期肉质根于液氮中速冻，于-80 ℃冰箱中保存备用。利用RNA 提取试剂盒从萝卜肉质根中提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 引物设计与PCR 扩增根据已发表的萝卜基因组数据［13］，设计并合成RsSCPL3基因的特异性引物SCPL-F：（5′-caccATGGCTAAGAAGTTGCTTC TGCTTC-3′）和SCPL-R：（5′-TTAGAGAGGTTGACCACTAATCCACCTC-3′）。以cDNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系为50 μL，其中cDNA 模板3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，酶（1U）1 μL，ddH2O 30 μL；PCR 扩增程序使用两步法：94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，68 ℃延伸1 min，35 个循环。

1.2.3 目的片段的回收、载体构建与测序 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用DNA 回收试剂盒进行目的条带的切胶回收，将回收产物连接到pENTER-TOPO 载体上，重组产物转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR 筛选阳性进行克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）进行RsSCPL3蛋白质的理化性质分析；利用ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白亲疏水性；利用Signalp 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）分析信号肽；利用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）预测跨膜结构域；利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测；利用NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）预测保守结构域；利用SPOMA（http：//www.ibcp.fr/predict.html/）预测蛋白质二级结构；运用MEGA 软件构建RsSCPL3 蛋白系统进化树（Neighbor-joining法，Bootstrap 值设置为1 000）。

2 结果与分析

2.1 RsSCPL3 基因克隆

以萝卜肉质根的cDNA 为模板，经PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳获得了1 500 bp 左右的目的片段（图1）。测序结果表明，RsSCPL3基因CDS 序列大小为1 434 bp，编码477 个氨基酸。

图1 RsSCPL3 基因克隆

2.2 RsSCPL3 蛋白理化性质的分析

预测RsSCPL3蛋白分子式为C2493H3762N632O709S21，相对分子质量为54.6 kD，原子总数为7 617，理论等电点（PI）为6.33。RsSCPL3 蛋白带负电荷残基（Asp+Glu）为49，正电荷电残基（Arg+Lys）为45，脂肪系数为81.30，不稳定系数为39.26，属于稳定蛋白。

ProtScale 预测RsSCPL3 蛋白平均亲水值为-0.227，且第9 位和第10 位的亮氨酸（Leu）表现最大疏水性，疏水均值为3.956，第63 位的天冬酰胺（Asn）表现最大亲水性，分值为-3.122，说明其为亲水性蛋白。

2.3 RsSCPL3 蛋白信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位

信号肽主要功能为促进蛋白质连续进入分泌途径并将蛋白质运送至细胞外，本研究利用Signalp 4.1 预测RsSCPL3 蛋白具有1 个信号肽（图2）。TMHMM 2.0 预测该蛋白存在3 个跨膜区域（图3），WoLF PSORT 预测其最有可能定位于液泡中，在细胞外基质和内质网膜上也可能有分布，表明其可能为分泌蛋白。

图2 RsSCPL3 蛋白信号肽预测

图3 RsSCPL3 蛋白跨膜结构域预测

2.4 RsSCPL3 蛋白保守结构域和二级结构预测

使用NCBI 的Conserved Domains 工具，预测发现RsSCPL3 蛋白具有1 个属于SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族的保守结构域（图4）。

图4 RsSCPL3 的保守结构域预测

SPOMA 预测RsSCPL3 蛋白二级结构，发现该蛋白由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成，其分别包含147、34、89 和207 个氨基酸，占比分别为30.82%、7.13%、18.66%和43.40%（图5）。

图5 RsSCPL3 蛋白二级结构预测

2.5 RsSCPL3 蛋白系统进化树

为明确RsSCPL3 与其他植物的系统进化关系，利用MEGA 软件构建系统进化树。结果表明，RsSCPL3 蛋白与甘蓝型油菜（Brassica napus）、甘蓝（Brassica oleracea）、芝麻菜（Eruca vesicariasubsp.sativa）、菥蓂（Thlaspi arvense）、盐芥（Eutrema salsugineum）等十字花科植物同源蛋白聚为一类，亲缘关系较近，而与苦瓜（Momordica charantia）、甜橙（Citrus sinensis）、大豆（Glycine max）、茶（Camellia sinensis）、曼陀罗（Datura stramonium）等亲缘关系相对较远（图6）。

图6 RsSCPL3 与其他植物同源蛋白的系统进化树分析

3 讨论

SCP/SCPL基因参与调控植物的多种生理过程。拟南芥（Arabidopsis thaliana）BRI1 在油菜素内酯信号转导中发挥作用［14］。通过表达AtECS1可增加油菜植株的心皮数、荚果种子数以及千粒重，且ECS1也可能参与油菜素内酯信号的转导过程［15］。水稻（Oryza sativaL.）GS5基因调控谷粒大小，在提高水稻产量方面具有重要意义［16］。烟草（Nicotiana tabacum）NtSCP1和NtSCP2基因参与调控细胞生长［17］，在植株形态发育方面起作用。豌豆（Pisum sativum）PsCP基因在种子生长发育中起重要作用［18］。

此外，SCP/SCPL基因在植物对生物和非生物胁迫的响应过程中也发挥重要作用。水稻OsBISCPL1能被BTH、JA、SA、ACC 等抗病信号分子诱导表达，并且在水稻和稻瘟病菌的非亲和性互作中上调表达［10］。干旱、盐、ABA、MeJA 和BR 诱导小麦TaSCPL184-6D显著上调表达［19］。玉米（Zea mays）Zm-SCP响应立枯丝核菌胁迫，且ABA、JA、高盐和低温处理均诱导其上调表达［20］。赤霉素诱导豌豆PsCP基因上调表达，而多效唑抑制其表达［18］。黄瓜（Cucumis sativusL.）中多个SCPL基因响应盐胁迫和白粉病菌侵染［21］。

4 小结

本研究从心里美萝卜中克隆出SCPL3基因并对其进行系统的生物信息学分析，其分子式为C2493H3762N632O709S21，是稳定亲水性分泌蛋白，含有SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族结构域，可能定位于液泡，存在1 个信号肽和3 个跨膜结构域，与甘蓝型油菜、芝麻菜等十字花科植物同源性较高。研究结果为下一步RsSCPL3基因的功能和表达调控机制研究奠定了基础。