湖北省郧西核桃炭疽病病原菌的分离鉴定

曹春霞，姚经武，黄大野，王蓓蓓，郑娇莉，杨 丹

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

核桃（Juglans regia）炭疽病是核桃生长过程中的重要真菌病害，可危害其叶片、果实、芽、花苞和嫩梢，引起叶斑、落叶、花腐、果腐和枝梢枯死，严重制约着核桃产业的发展，影响农民收益［1］。其病原菌主要有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）［2，3］、果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）［4］、核桃盘二孢菌（Marssonina juglandis）［5］、暹罗刺盘孢菌（Colletotrichum siamense）［6，7］和尖孢刺盘孢复合种（Colletotrichum acutatum）［8］。湖北省郧西县核桃炭疽病大发生，但病原种类尚不明确。

本研究以2022 年郧西县棋盘山核桃基地中的病叶为材料，旨在以形态学鉴定为基础，结合分子生物学（ITS和看家基因）对病原菌进行分离鉴定，以期明确该地区核桃炭疽病的病原种类，为该病害的后续研究和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃炭疽病的感病叶片以及健康叶片、果实于2022 年采自郧西县棋盘山核桃基地。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L。

E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit、TaKaRa PCR Mix RR901A、武汉瑞华光照培养箱、哈东联超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、BIO-RAD C1000 Touch Thermal Cycler PCR 仪、君意JY300C 电泳仪、OLYMPUS BX43 显微镜、ABI 3730XL 测序仪、恒温水浴锅、培养皿等。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离纯化 采用组织分离法［9］。新鲜病叶清洗干净，将叶片病健交界处组织切成小块，用75%乙醇消毒3 s，放入5%次氯酸钠中浸泡3～5 min，无菌水漂洗3 次，待小块组织表面晾干，用接种针将组织块移入PDA 培养基表面，每平板放5 片，培养皿密封后放入25 ℃培养箱培养。待组织边缘长出菌丝后，将菌丝块转接到新的PDA 平板上进行纯化培养，待纯化的菌落产孢后，通过单孢分离获得纯的病原菌。

1.2.2 形态学鉴定 将病原菌接种在PDA 平板上，置于25 ℃条件下培养10 d，观察菌落形态和颜色；培养15 d 后，用无菌水将孢子洗脱下来，三层擦镜纸过滤，显微镜下观察分生孢子形态和大小，并拍照保存。

1.2.3 分子生物学鉴定 收集病原菌菌丝，采用E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit 提取病原菌DNA，所用引物为ITS和3 对看家基因［6］（表1）。25 μL PCR 体系为Premix Taq（TaKaRa Taq ™Version 2.0 plus dye）12.5 μL，DNA（40 ng/μL）1 μL，引物F/R（10 μmol/L）各1 μL，灭菌蒸馏水9.5 μL。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min；每个循环94 ℃变性30 s；56 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s，共32 个循环；最后72 ℃延伸5 min，反应结束后，凝胶电泳回收扩增片段，纯化后的DNA 片段送北京擎科生物科技有限公司测序。

表1 扩增ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 基因序列的引物

1.2.4 致病性鉴定 分别采用菌丝块和分生孢子液刺伤接种离体核桃叶片和果实进行致病力测定。在菌丝块接种试验中，病原菌在PDA 平板上25 ℃培养2～3 d，然后用孔径6 mm 的灭菌打孔器在菌落边缘打取菌丝块，接种于核桃叶片和果实上的刺伤点（菌丝面向下贴紧叶片和果实表面）。每片叶片接种2 个菌丝块，每处理重复6 片叶片；每个果实接种1个菌丝块，每处理重复6 个果实。

在分生孢子液接种试验中，首先用无菌水从培养了15 d 的菌落平板上洗下分生孢子，并用三层擦镜纸过滤收集孢子液，离心后PDB 重新悬浮。通过血球计数板将孢子液浓度调至1×106个/mL。在每片待接种的植株叶片刺伤点上放置6 片灭菌的滤纸片（直径6 mm）。吸取分生孢子液20 μL 滴加在各滤纸片上。每片叶片接种6 个滤纸片，每处理重复6 片叶片；每个果实滴加20 μL 孢子液，每处理重复6 个果实。

接种完成后，将叶片和果实置于放有湿润吸水纸的浅盘中，保鲜膜密封后置于25 ℃和12 h 光照/12 h 黑暗条件下保湿培养，接种发病后，采用组织分离法分离发病部位病原菌，鉴定分离到的病原菌性状是否与原始菌株相同。

1.3 系统进化树分析

将ITS、ACT、GAPDH和HIS3基因的序列合并后，利用ML 法构建系统发育树，自展支持率分析采用1 000 次重复，并使用稻瘟菌菌株Magnaporthe oryzaPO-FA28 的对应基因序列为外群［10］。

2 结果与分析

2.1 核桃叶部病害田间症状

对郧西县棋盘山核桃基地的核桃叶部病害进行了田间症状观察，发现炭疽病是其重要病害，主要为害叶片。发病初期为圆形小斑点，随后在叶尖及叶缘形成大小不同的褐色病斑，呈不规则形状，发病后期叶部病斑极易碎裂、脱落，形成穿孔症状，叶片焦枯脱落。

2.2 病原菌的形态鉴定

采用组织分离法分离得到真菌菌株NYF2-2，菌株在25 ℃条件下生长良好，产生白色菌丝，向四周辐射状生长，随着培养时间延长，慢慢形成圆形菌落，7 d 左右长满培养皿，初期菌丝为白色絮状，菌落边缘光滑规则。培养10 d 后，菌落背面可见黄绿色色素沉积（图1A 和图1B）；菌株分生孢子是单孢，长椭圆形，两端钝圆，孢子大小为（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm（图1C）。经菌落特性和孢子形态初步确定NYF2-2 属于刺盘孢属（Colletotrichumspp.）真菌。

图1 菌株NYF2-2 在PDA 培养基上的菌落形态（25 ℃，10 d）和分生孢子

2.3 病原菌的分子鉴定及系统进化分析

利用引物ITS4/ITS5及3 对看家基因引物对真菌DNA 进行扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳均可检测到单一清晰的条带，条带回收后测序。测得所有序列在NCBI 网站上进行BLAST 分析，结果表明，所有序列都与胶孢炭疽菌的同源性最高，均可达到100%；系统发育树结果表明，菌株NYF2-2 和4 个胶孢炭疽菌菌株（C.gloeosporioidesCBS 112999、C.gloeosporioideslq27、C.gloeosporioideslq30 和C.gloeosporioideslq35）聚为同一分支（图2）。因此，根据形态学特征及多基因系统发育分析，将病原菌NYF2-2 鉴定为胶孢炭疽菌。

图2 菌株NYF2-2 基于ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 4 个基因合并序列用NJ 法构建的系统发育树

2.4 病原菌的致病力测定

菌丝块接种离体核桃叶片4 d 后病斑明显，呈黑褐色（图3B）。菌丝块接种离体核桃果实7 d 后，病斑清晰可见（图3F），随着侵染时间增加，病斑面积逐渐扩大；分生孢子液接种离体核桃叶片5 d 后出现明显病斑（图3D），分生孢子液接种离体核桃果实7 d 后出现明显病斑（图3H），后期病斑处易形成橘红色孢子堆，所有病斑形态与田间叶片发病症状一致，发病的病斑经过重新分离，重新获得的菌株与原始菌株培养形态相同，表明菌株NYF2-2 是核桃炭疽病的病原菌。

图3 菌株NYF2-2 接种离体核桃叶片和果实的发病症状

3 小结与讨论

湖北省郧西县核桃基地炭疽病发生危害程度日益严重。为了有效控制核桃炭疽病的暴发流行，明确病原种类十分必要。本研究于2022 年6 月从核桃发病叶片上分离到1 株强致病力菌株NYF2-2，将菌株进行离体接种可使核桃叶片和果实发病，回接病叶和果实后再分离，得到的菌株与原分离菌株培养形态相同，经柯赫氏法则验证该菌株为核桃炭疽病的病原菌。通过培养特性和多基因序列（ITS、ACT、GAPDH和HIS3）分析，将菌株NYF2-2 鉴定为胶孢炭疽菌，表明胶孢炭疽菌是引起郧西县核桃产区炭疽病暴发流行的主要致病菌。菌株NYF2-2 在PDA 培养基上的培养形态为灰白色，7 d 后逐渐变为灰绿色。分生孢子单孢、无色、长椭圆形，大小为（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm，与已报道的胶孢炭疽菌的分生孢子形态、大小基本一致［10］。

有研究对其他省市的核桃炭疽病病原进行了报道，如山东省济南市［7］的核桃炭疽病病原菌为暹罗刺盘孢菌，陕西省核桃炭疽病的病原为咖啡刺盘孢（C.coffeanum）［11］等。本研究是关于湖北省郧西县核桃炭疽病病原的首次报道。1 种炭疽菌可以侵染几种寄主植物，也可以几种炭疽菌侵染1 种寄主植物。如引起葡萄炭疽病的有胶孢炭疽菌C.gloeosporioides［12］，引起辣椒炭疽病的有C.acutatum、C.truncatum、C.fructicola和C.siamense4 种炭疽菌［13-15］，而C.acutaum和C.gloeosporioides均可以引起草莓炭疽病［16］。本研究仅对从病叶上分离到的1 株强致病性菌株进行了鉴定，至于核桃上是否存在其他炭疽菌还需进行后续研究，同时，该病原菌的生物学特性、所致病害的发病规律等还需继续研究，以便制定行之有效的防治方案。