甘露糖抑制猫尿路感染的功能研究

张若男，吕雷

（卫仕宠物营养研究院，安徽芜湖 241200）

猫的尿路感染是指由细菌感染所引起的泌尿道炎症性疾病，包括肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎等[1]。 尿路细菌感染会使尿液中铵离子浓度增加，促进矿物质盐类析出形成结晶，从而形成尿路结石[2]。尿路感染与尿路结石是宠物猫多发疾病，伴有排尿困难、血尿等症状[3]。大肠杆菌（Escherichia coli）是最常见的诱发猫尿路感染的病原菌，对大肠杆菌具有抗菌活性的抗生素能够有效控制猫尿路感染的发生[4]。 甘露糖是一种广泛存在于自然界多种植物中的糖类，在哺乳动物血浆中的浓度为50～100 μM[5]。有研究表明，甘露糖可以代替抗生素用于治疗人类的复发性尿路感染，发挥卓越的抗感染作用[6]。 西方国家也将甘露糖用作人类保健品，用以预防尿路感染，保护泌尿系统健康[7]。 鉴于甘露糖对人类尿路感染的预防和治疗作用，本研究着眼于目前动物临床上猫尿路感染疾病多发的情况，探究了不同浓度的甘露糖对猫尿路感染病原菌（大肠杆菌）增殖活性的影响，并以猫肾上皮细胞系（CRFK）为载体，探究了不同浓度的甘露糖对大肠杆菌感染的猫肾上皮细胞的保护作用，以期为猫尿路感染的治疗和预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系及菌株

猫肾上皮细胞（CRFK，PWE-CT001）购于大连美仑生物技术有限公司，大肠杆菌（HBJZ087）购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 材料与试剂

DMEM 高糖细胞培养基（MA0212-2）、细胞培养级PBS （MA0015-2）、 青霉素/链霉素灭菌溶液（MA0110-1）购于大连美仑生物技术有限公司，胎牛血清 （10100147） 购于 Gibico 公司， 氯化钠（10019308）、甲醇（10014108）购于国药集团化学试剂有限公司，EDTA（0.25%）-胰蛋白酶（40127ES60）购于上海翌圣生物科技有限公司，甘露糖（M2069）购于默克公司，改良吉姆萨染色液（C0131）购于碧云天生物。

1.3 主要仪器

主要仪器设备见表1。

表1 主要仪器一览表

1.4 试剂配制

细胞完全培养基： 在DMEM 高糖细胞培养基中添加10%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素灭菌溶液。LB 液体细菌培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，加纯净水定容至1 L。

1.5 试验分组与处理

1.5.1 大肠杆菌增殖试验。 将大肠杆菌接种至LB 液体培养基中，设置如下分组。 对照组：不含甘露糖的LB 培养基；5 mM 甘露糖处理组：含5 mM 甘露糖的LB 培养基；10 mM 甘露糖处理组：含10 mM 甘露糖的LB 培养基。 将上述3 组大肠杆菌培养液置于卧式光照振荡细菌培养箱内，37 ℃、250 r/min 培养16 h。 重复上述试验3 次。

1.5.2 大肠杆菌感染试验。 将CRFK 细胞接种于6 孔板中，在含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。 待细胞生长状态良好时，将培养基更换为不含抗生素的细胞培养基并设置如下分组。 对照组：细胞培养基正常培养；大肠杆菌感染组:细胞培养基中加入大肠杆菌（OD600=0.5）；5 mM 甘露糖处理-大肠杆菌感染组：培养基中含5 mM 甘露糖， 加入大肠杆菌攻毒1 h（OD600=0.5）；10 mM 甘露糖处理-大肠杆菌感染组：培养基中含10 mM 甘露糖， 加入大肠杆菌攻毒1 h（OD600=0.5）。 重复上述试验3 次。

1.6 试验结果检测

1.6.1 大肠杆菌增殖试验。 将培养16 h 后的各组大肠杆菌培养液充分摇匀，分别取100 μL 置于96 孔板中，通过酶标仪检测OD600值以反映菌液浓度。

1.6.2 大肠杆菌感染试验。CRFK 细胞培养过程中，在倒置显微镜下观察并拍摄细胞的生长状态。 对细胞进行大肠杆感染菌后，使用PBS 清洗3 遍，加入甲醇固定15 min， 然后使用改良吉姆萨染色液染色30 min 并清洗干净，在倒置显微镜下观察并拍摄细胞形态与大肠杆菌感染情况， 最后使用Image J 软件对上述拍摄图片中的大肠杆菌数目与细胞数目进行统计，通过大肠杆菌数/CRFK 细胞数的比值来反映大肠杆菌感染情况。

1.7 数据统计与分析

采用GraphPad Prism 8 统计学软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准误”表示；采用单因素方差分析对各组结果进行差异显著性分析，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。

2 结果与分析

2.1 甘露糖对大肠杆菌增殖的影响

如图1 所示，经过16 h 的摇菌培养后，相比于对照组，5 mM 甘露糖处理组和10 mM 甘露糖处理组的大肠杆菌菌液浓度均极显著降低（P<0.001），表明甘露糖对大肠杆菌的增殖具有抑制作用。

图1 甘露糖对大肠杆菌增殖的影响

2.2 甘露糖对大肠杆菌感染的CRFK 细胞的影响

如图2 和图3 所示， 未受大肠杆菌感染的CRFK细胞生长状态良好，但经过1 h 的感染试验，与对照组相比，大肠杆菌感染组的细胞发生了明显的细菌感染。 如图4 所示，5 mM 甘露糖处理-大肠杆菌感染组和10 mM 甘露糖处理-大肠杆菌感染组的细胞被细菌感染的程度极显著降低（P<0.000 1），其中10 mM甘露糖的效果更佳，表明甘露糖能够极显著抑制大肠杆菌对CRFK 细胞的感染（P<0.000 1）。

图2 未受感染的CRFK 细胞的生长状态

图3 大肠杆菌对CRFK 细胞的感染

图4 大肠杆菌数/CRFK 细胞数

3 讨论

尿路感染与结石疾病不仅给猫带来排尿障碍与疼痛，也会严重影响猫的精神状态与食欲，导致其免疫力下降引发更严重的疾病[8]。 动物临床上对于猫尿路感染与尿石症的治疗主要是通过抗感染药物治疗和溶解疗法，对于病症严重者会采用手术治疗[9-10]。 虽然动物临床上对于猫尿路感染与尿石症已经有了较完善的治疗策略，但是在此过程中猫仍无法避免疾病带来的痛苦与治疗的恐惧，因此预防该类疾病的发生能够改善宠物猫的生存质量。

甘露糖在维护人类泌尿系统健康方面的作用已经获得了认可[6-7]。本研究通过试验探究了甘露糖在猫泌尿系统健康中的潜在作用，发现甘露糖能够抑制猫尿路感染的病原菌——大肠杆菌的增殖，并抑制大肠杆菌对猫肾上皮细胞的感染。 在小鼠体内的试验表明，以20%（m/V）的甘露糖水溶液作为饮用水，不会干扰实验小鼠的正常生长发育[11]，这表明甘露糖对动物具有较高的安全性。 因此，甘露糖有望作为猫的食品添加剂或保健品，用以预防尿路感染，保持泌尿系统健康。另外，蔓越莓富含甘露糖与多种维生素。蔓越莓提取物能够抑制人类尿路上皮细胞的感染[12]，同时蔓越莓提取物与甘露糖联合应用能够促进抗生素对急性尿路感染治疗的敏感性[13]。 因此使用甘露糖作为食品添加剂有望对保持宠物猫泌尿系统健康产生一定的积极作用。