高能量饮食对幼龄实验动物的影响

张苗，高甜，杜晓鹂，岳鑫，张微，王芳，曹晓东，韩秀丽

（1.内蒙古医科大学药物安全评价中心，内蒙古呼和浩特 010059； 2.陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046）

动物自发性背景病变与供应商、遗传和饮食以及饲养环境等因素有关。 将致病因素作用于动物，导致动物组织、器官或全身发生一定改变，出现某些类似人类发生疾病时表现的功能、代谢或形态结构方面的变化，被称为诱发性病变。 饮食结构和采食频率会影响身体健康。 机体自身的代谢能力决定了发育所需的能量摄入是否符合或超过身体需求。 过去30 多年来，我国儿童肥胖发生率不断攀升，究其原因与人们的饮食习惯有较大关系。 食物的摄入量和消耗量不均衡，是造成肥胖的主要原因。 不健康的饮食习惯会加重身体组织器官的负担， 引起慢性疾病的发生。因此，在本试验中笔者将高能量饮食作为主要影响因素，给予实验动物自由采食生活中低龄儿童经常摄入的高能量食物奶酪及蛋黄，观察动物自发性疾病的发病情况及高能量食物对动物生长发育的影响，旨在为提高实验动物质量和进一步开展医药科学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠20 只，6～8 周龄，雌、雄各半。 购自北京斯贝福生物有限公司，许可证号为SCXK（京）2019—0010。

1.2 试验方法

1.2.1 动物饲养。 将SD 大鼠随机分为正常采食组和自由采食组，于普通环境中饲养3 个月。 正常采食组饲喂生长期鼠粮；自由采食组饲喂生长期鼠粮混合奶酪及蛋黄[采食标准为平均生长期鼠粮15 g/（只·d）混合15 g 高能量饮食（奶酪和蛋黄）]，自由饮水。

1.2.2 动物处理。 过夜禁食禁水10 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg 诱导麻醉，腹主动脉放血。 按试验要求，分别摘取肾脏（膀胱）、肝脏、心血管、小肠、肺、气管、胸腺、大肠、脾脏、胃和生殖器官（雌性：子宫、卵巢；雄性：睾丸、附睾、前列腺、精囊）、胰腺。 10%中性甲醛溶液固定。

1.2.3 病理检查。 按照动物标本处理程序进行脱水、石蜡包埋、4.0 μm 切片、苏木素-伊红（HE）染色及中性树胶封片。 光学显微镜下观察病变。

1.2.4 仪器和试剂。Leica Auto Strainer XL 自动染色机、Leica EG 1150H 包埋机、Leica EG 1150C 制冷机、Leica RM 2235 全能型手动切片机、Leica ASP 200S 组织脱水机、DM 2000 荧光显微镜，均为徕卡生物系统有限公司产品；ZMN-6802 Water Bath-slide Drier，东莞市厦台大电子设备厂公司产品；病理级显微镜载玻片；二甲苯，购自天津市富宇精细化有限公司；无水乙醇，购自天津市风船化学试剂科技有限公司； 中性树胶， 购自国药集团化学试剂有限公司；0.01 mol/L PBS，购自福州迈新生物技术开发有限公司；石蜡，购自徕卡生物系统里士满有限公司；苏木色精，购自天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2.5 病理诊断标准。 根据实验动物组织病变半定量分析的非线性分级方案[1]见表1。

表1 用于实验动物组织非肿瘤性病变半定量分析的非线性分级方案

2 结果与分析

2.1 正常采食组脏器病理变化镜检特点

正常采食组病变（n=10）情况如表2 所示。肾小管刷状缘缺失、上皮细胞空泡变性、细胞肿胀、肾小管上皮细胞脱落极轻度（1/10），轻度（4/10）（图2A）；肝细胞点状坏死，小叶中心带肝细胞缺失，炎细胞浸润极轻度（1/10），轻度（1/10）；肝脏组织中可见微小肉芽肿极轻度（1/10），轻度（1/10）（图2B）；心肌间质少量炎细胞浸润极轻度（1/10）（图2C）；大肠黏膜下炎细胞浸润极轻度（2/10），轻度（3/10），中度（1/10）（图2D），黏膜下淋巴相关组织增生；小肠黏膜下淋巴相关组织增生极轻度（3/10），轻度（1/10） （图2E）；支气管及血管周围炎细胞浸润、脓肿；支气管相关淋巴组织增生极轻度（8/10）（图2F）；肺间质充血，水肿极轻度（1/10），轻度（1/10）（图2G）；胰腺无可记录的变化（图2H 和2I）。

图2 正常采食组病变（HE 染色）

表2 SD 大鼠正常采食组病变发生例数（非线性分级方案，n=10）

2.2 自由采食组脏器病理变化镜检特点

自由采食组病变（n=10）情况如表3 所示。肾小管间质炎细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、变性脱落极轻度（3/10），轻度（3/10）（图3A）；肾脏皮质髓质均可见蛋白管型轻度（2/10）（图3B）； 肝细胞肿大极轻度（1/10）， 轻度（1/10）（图3C）； 肝细胞变性极轻度（3/10），轻度（2/10）；心肌细胞片状坏死，局部心肌纤维断裂，伴有大量淋巴细胞浸润，极轻度（1/10）（图3D）；大肠黏膜下相关淋巴组织增生，黏膜变厚，正常黏膜结构损失，黏膜细胞肥大增生极轻度（1/10），轻度（1/10），中度（1/10）（图3E）；支气管相关淋巴组织增生，肺泡腔可见大量泡沫细胞、脓肿极轻度（2/10），轻度（1/10）（图3F），间质性肺炎极轻度（1/10），轻度（2/10）（图3G）；胰腺外分泌部萎缩，极轻度（1/10）；胰岛炎细胞浸润、纤维化，间质单个核细胞浸润，伴有极轻度损伤（1/10）（图3H）；小肠黏膜下相关淋巴组织增生极轻度（1/10），轻度（1/10）（图3I）。

图3 自由采食组病变（HE 染色）

表3 SD 大鼠自由采食组病变发生例数（非线性分级方案，n=10）

3 讨论

大鼠是啮齿类动物，包括Wister、Sprague Dawley和Fischer 344 在内的多个品系。 SD 大鼠个体差异小，数据比较准确，已经在国际生物医药领域中得到广泛认可，是药物安全性评价和科研工作中经常使用的动物[2]。在本试验中发现，自由采食组和正常采食组中肾脏病变发生率最高，其次是肝脏和肺脏。 肝脏和肺脏的自发性疾病通常是炎症，其特征为单核细胞浸润；大肠和小肠病变发生率最高的是黏膜下淋巴组织增生；心肌病发生率均较低。

3.1 肝脏

正常采食组中，肝细胞点状坏死（2/10），微小肉芽肿（2/10）；自由采食组中肝细胞肿大（2/10），肝细胞变性（5/10）。 自由采食组的病变数量及程度都高于正常采食组。 在本试验中，自由采食组在剖检及取材时发现肝脏体积偏大、颜色发黄、表面滑腻、边缘钝圆。 镜检时观察到部分区域肝板结构消失，肝细胞出现不同程度的肥大、肿大、变性和坏死等现象。 肥大的肝细胞通常呈小叶中心性分布，胞质增多，对细胞核的大小几乎没有影响[3]。 试验中观察到的肝脏脂肪变性有2种情况，即大泡性脂肪病变和小泡性脂肪病变。 大泡性脂肪病变是常见病变，属于不严重的病变，常与饲养条件和自身代谢机能相关。 小泡性脂肪病变被视为严重性病变， 肝细胞胞质充满大量的小脂质空泡，常呈现泡沫状外观，胞核位于细胞中央。 肝细胞空泡化，出现小泡性肝细胞变性； 肝细胞肥大呈灰白色颗粒状，肝细胞的核/胞浆比值较小，胞浆肉眼可见更明亮[4]。啮齿类动物过度饲养是产生肝脂肪变性[5]的原因之一， 而肝细胞脂肪变性通常发生于肝内脂肪≥5%肝脏重量时[6]。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是指在并未饮酒的情况下出现肝细胞脂肪变性。 这也是很多发达国家/地区慢性肝病的常见病因， 被认为是代谢综合征的肝脏表现，与肥胖、血脂异常和糖尿病等相关。 改变生活方式（如减重、增加体力活动和改变饮食）是缓解该类疾病的治疗方案。

3.2 肾脏

在正常采食组中，肾小管上皮细胞肿胀、变性、脱落（5/10）；自由采食组中蛋白管型（2/10），肾小管上皮细胞肿胀、变性脱落（6/10）。 自由采食组在剖解及取材时可见肾脏体积与正常相比偏大，呈色黄。 镜检时观察到部分肾小管扩大、上皮细胞空泡变性，皮质、髓质均可见蛋白管型。 肾小管扩张可能是由单个肾小管上皮细胞坏死或缺失引起。 肾小管上皮缺失时，相邻的上皮细胞延伸填充缺损并覆盖裸露的基底膜。 肾小管上皮空泡的形成很大程度上是一种可逆的退行性改变[3]。空泡形成也可能是坏死前的一种早期表现，但常常伴随特定类型的肾小管损伤，如液体蓄积[7]。正常肾脏含有适量的脂肪和类脂，不同种属的动物含量各异。 在肾小球系膜中，脂质还可以聚集成微小的空泡，从而产生“泡沫细胞”[8]。 透明管型HE 染色镜下呈粉红浅染，主要是肾小球通透性增加，血中蛋白漏出，肾小管重吸收障碍引起的。 各种类型的肾小球损伤及蛋白漏出均可以在肾小管内形成管型。 一般来说，各种肾损伤的急性期或早期，管型不明显，到慢性期管型明显加重， 大鼠自发性慢性进行性肾病（chronic progressive nephropathy，CPN）与其他因素引起的肾小管管型有很大不同。 慢性进行性肾病引起的病变特征表现为基底膜增厚、 肾小管嗜碱性和肾小管扩张，蛋白管型、间质纤维化等。 慢性进行性肾病是老龄大鼠发生的常见自发性疾病[9]，该病更多见于雄性大鼠，直接受高蛋白、高热及高盐饮食日粮影响。 这种饮食结构会使更多的蛋白通过肾小球沉积在肾小管内。

3.3 肺脏

在正常采食组中，肺间质充血、水肿（2/10），支气管旁血管周围炎细胞浸润、淋巴滤泡增生（8/10）；在自由采食组中，支气管旁血管周围炎细胞浸润、淋巴相关组织增生（3/10），肺泡腔可见异物及大量泡沫细胞、并出现脓肿现象（3/10）。 在剖检及取材时，肉眼可见肺部表面呈现多处片状或点状的灰白色和灰黄色斑块。 镜下可见支气管相关淋巴组织增生、间质充血水肿；肺泡内可见大量的泡状细胞。 这些细胞在肺泡内一般分布在肺的边缘。 当肺组织发生纤维化时，会出现大量的细胞堆积，这些细胞可能是由于炎症引起的[10]。 正常情况下肺泡壁有巨噬细胞的存在，通过吞噬吸入肺内的异物或其他杂质， 变成泡沫样细胞，长期吞噬吸入会出现泡沫状巨噬细胞蓄积的现象[11]。 肺泡巨噬细胞作为呼吸道的第一道防线，除了具有巨噬作用之外，更重要的是它利用其分泌的多种介质参与到肺内细胞间的相互作用和信息传递中，并对肺内生理过程展开经常性的细胞保护和细胞调节[12]。 巨噬细胞功能的变化可以反映肺部防御功能的改变，同时这也是细颗粒物与肺部疾病之间存在密切关系的可能原因之一[13]。图3F 中出现的异物可导致由多核巨细胞和其他炎症细胞组成的肉芽肿性反应。 肺部出现病变大多与炎症有关，比如肺炎、肺脓肿等症状，也与生存环境、外部感染、遗传等原因有关。

3.4 心脏

在正常采食组中， 心肌间质有少量炎细胞浸润（1/10）；在自由采食组中，心肌细胞坏死（1/10）。 心肌细胞坏死通常是由冠状动脉堵塞导致血流中断，从而引发心肌组织细胞出现缺血、坏死等情况。 坏死伴随着不同程度的炎症。 炎症程度取决于有害因子，也与感染或饮食失调有关。 自发性心肌病是一种常见的疾病，多见于雄性大鼠。 这种疾病的病因并不清楚，但其发病程度和发病时间与饮食、环境和应激等因素有关[14]。自发性心肌病随着年龄的增加而增加，更多出现于易患血管病变的高血压大鼠[15]。由于该病变是进行性发展，所以早期病变中可见心肌纤维变性、坏死，并伴炎细胞浸润。 一般3～4 个月龄可见其早期病变，24 月龄大鼠发病率接近100%[16]。 不良的生活环境以及不健康的生活习惯都会对心脏产生很大的影响。 高强度的噪声及严重的环境污染是诱发各类型心脏病的常见因素。 改善生活环境和多运动是预防该类疾病的有效方式。

3.5 大肠和小肠

大肠和小肠的病变均为黏膜下相关淋巴组织增生。 正常采食组大肠黏膜下淋巴组织增生（6/10），小肠（4/10）；自由采食组黏膜下淋巴组织增生（3/10），小肠（2/10）。 大肠小肠剖检及取材时可见组织表面有黄白色大小不一的明显突起。 大肠黏膜含有隐窝，其基底部偶有分支。 表面上皮含有肠上皮细胞，而大部分隐窝被产生黏膜的杯状细胞占据。 结肠黏膜含有黏膜皱襞，在溃疡性结肠炎大鼠中有明显体现[17]。 大肠和小肠黏膜细胞增生由各种不同因子的刺激引起[18]。 在本试验中，大肠和小肠黏膜的组织学改变表现为黏膜腺体变深，杯状细胞数目增多。 杯状细胞增生是一种结肠和小肠都可以发生的自发性病变， 但是病因不明。 食物纤维与肠道菌群的互动也会影响肠道的发育[19]。 结肠黏膜发炎，一般并无明确的组织病理学特点。 在较早或病变较轻微时，腺体和表皮的黏膜仍然完好，但是有明显的黏液缺失。 该病变的特点是杯状细胞内黏液减少，胞浆嗜碱度增加[20]。 炎症现象通常出现在摄入了特别刺激的食物，或者是有细菌、病毒等微生物感染的时候，所以饮食习惯尤为重要。

3.6 胰腺

胰腺病变只出现在自由采食组中，表现为外分泌部萎缩（1/10），胰岛炎细胞浸润、纤维化（1/10）。 胰腺腺泡萎缩可见于幼龄和老龄大鼠。 该病变包括带有残存导管的腺泡萎缩、轻度炎症反应。 胰岛中偶尔可见炎症细胞，纤维化被认为是血细胞从血循环漏出到胰岛内导致的。 受影响的组织表现出腺泡数量减少，且由于腺泡细胞萎缩和失去分化，小管状的结构明显增多。 大鼠自发性胰腺萎缩的原因尚不清楚。 胰腺外分泌部萎缩会引起慢性胰腺炎，病因与胰腺导管阻塞有关。 慢性胰腺炎早期病变的组织学特点是间质单核细胞浸润，伴有实质不同程度的轻度损伤。 在晚期的病例中，腺泡组织逐渐消失。