青稞种质资源籽粒赖氨酸含量的评价

刘美池，邓 歆，刘新春，杨可涵，倪子涵，何 雪，马孝玲，冯宗云*

（1.四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室/农学院大麦青稞等健康功能作物研究中心，四川 温江 611130；2.四川省农业科学院作物研究所，四川 成都 610066）

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudumHook.f.）是普通栽培大麦种（Hordeum vulgareL.）的裸大麦变种[1]，栽培于大麦生态区划中的裸大麦区，主要分布在我国的西藏、青海全境，四川的甘孜藏族自治州、阿坝藏族羌族自治州及凉山彝族自治州（木里藏族自治县），云南的迪庆藏族自治州，甘肃的甘南藏族自治州等青藏高原地区[1-3]。青稞是藏区重要的特色农作物，籽粒富含重要的营养功能成分[4-7]，具有“三高（高蛋白、高可溶性纤维、高维生素）两低（低脂肪、低糖）”的营养特征，是藏族人民的重要食粮，被广泛应用于各种速食品、酿酒和保健食品的开发[6]。赖氨酸是人体必需的氨基酸之一，它能够促进人体的发育，增强免疫力并有提高中枢神经功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸，由于谷物中的赖氨酸含量低，并且在加工过程中容易被破坏而缺乏，故被称为第一限制性的氨基酸。

青稞籽粒中的赖氨酸含量是评价青稞营养品质的重要指标，已受到青稞育种家的广泛关注。研究青稞籽粒中赖氨酸的含量水平，对了解青稞种质资源赖氨酸含量的变异，评价和筛选出高赖氨酸含量的材料，选育高赖氨酸含量的新品种及提升青稞营养品质均具有重要的意义。

据报道，大麦籽粒的赖氨酸含量高于其他谷类作物[8-9]。国外于20 世纪70 年代在筛选和选育高赖氨酸大麦上就已取得较大成就[10]。张丽华等分析了全国5 977 份大麦样品籽粒的赖氨酸含量（质量分数，下同），变异幅度在0.30%～0.75%，平均含量为0.47%，变异系数13.1%，筛选出含量在0.58%以上的高赖氨酸材料66 份[9]。张丽华等研究发现，赖氨酸含量在0.30%～0.39%的材料数占18.9%，0.40%～0.49%的占66.1%，0.50%～0.57%的占13.9%，0.58%～0.75%的占1.1%，春大麦区最高，高纬度地区大麦籽粒赖氨酸含量高于低纬度地区，呈现出区域性分布[11]。陈丽娟等分析了25 份皮大麦籽粒赖氨酸含量，平均为0.45%[12]。马得泉等分析了2 008 份西藏野生大麦籽粒赖氨酸含量，变幅在0.33%～0.74%，平均为0.47%；大部分材料在0.40%～0.59%，占84.5%，而0.60%～0.74%仅占5.4%；西藏栽培大麦仅2 份材料籽粒赖氨酸含量高于0.60%[13-14]。黄志仁等在1997—1999 年3 年中测定了27 个大麦品种的赖氨酸含量，表明年份间有一定的变化，但各年中品种间的高低顺序一致[15]；他们后续又测定了8 个皮大麦品种籽粒赖氨酸含量，变幅在0.261 0%～0.663 8%，品种间差异达极显著水平[16]。范士靖等分析了14 个大麦品种籽粒赖氨酸含量，变幅为0.47%～0.62%[17]。张环等分析了95 份大麦籽粒赖氨酸含量，变幅为0.422%～0.616%[18]。但有关青稞（裸大麦）籽粒赖氨酸含量的报道并不多见[9,11,14,16,19-27]。张丽华等研究表明，裸大麦的赖氨酸含量平均高于皮大麦，一般在0.31%～0.60%[9,11]。陈丽娟等分析了103 份裸大麦籽粒赖氨酸含量，平均为4.7 g/kg[12]。黄志仁等分析了6 份裸大麦籽粒赖氨酸含量，发现品种间差异极显著，含量在0.322 1%～0.536 7%[16]。姚豪颖叶等分析认为，13 份青稞材料赖氨酸含量在0.188%～0.437%[20]。

赖氨酸主要存在于动物性食物和豆类中，谷类食物中赖氨酸含量很低，赖氨酸在促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑情绪等方面都具有积极的营养学意义，同时也能促进某些营养素的吸收，能与一些营养素协同，更好地发挥各种营养素的生理功能。因此，本文对来自我国青藏高原的166 份青稞品种（系）进行籽粒赖氨酸含量测定，分析不同地区籽粒赖氨酸含量的变异，筛选出高赖氨酸含量青稞材料，并进行聚类分析，通过评价青稞种质资源赖氨酸含量的变异程度，筛选高赖氨酸含量的种质资源，提出新的赖氨酸含量分级标准，以期为选育出高赖氨酸含量的青稞新品种、提升青稞营养品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

166 份供试青稞材料来自我国青藏高原的不同地区，其中西藏86 份、四川28 份、青海44 份、甘肃8 份（表1）。所有材料均保存在四川农业大学国家大麦青稞产业技术体系成都综合试验站。

表1 供试青稞材料的编号、名称及其来源

1.2 田间种植

2019 年10 月28 日将所有材料播种于成都市羊马街道福田村国家大麦青稞产业技术体系成都综合试验站试验基地（103°70′E、30°66′N），行长2.0 m，行距0.25 m，株距0.05 m，随机区组试验设计，3 次重复。田间管理同大田。籽粒成熟时去掉边株，取中间植株混收脱粒晒干后于-4 ℃下保存备用。

1.3 赖氨酸含量的测定

1.3.1 标准曲线的制作。取7 只洁净带塞试管，编号后分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 50 μg/mL 亮氨酸标准液，然后依次加入2.0、1.9、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL 蒸馏水，混匀后再向每支试管内加入2.0 mL 4%碳酸钠溶液和0.02 g/mL 茚三酮试剂[18]2.0 mL，摇匀，并于80 ℃保温30 min后，用冷水冷却试管至室温；再向每支试管内加入95%乙醇4.0 mL，混匀后于530 nm 处测吸光度A，以所得吸光度为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 试验样品处理。将青稞籽粒粉碎，将过80～100 目筛的细粉放入广口瓶中，加入适量60～90 ℃的石油醚至淹没粉面，浸泡8 h 进行脱脂。过滤后，用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂的青稞粉末晾在干净的滤纸上，待石油醚吹干。收集干粉，置于干燥器内，保存备用。

1.3.3 样品的测定。取15 mg 经处理后得到的青稞粉末于具塞干燥试管内，加2%碳酸钠1.0 mL，置于80 ℃水浴中提取20 min，然后加茚三酮试剂2.0 mL 进行30 min 的保温显色，冷却后加60%乙醇3.0 mL，混匀后过滤得滤液，在530 nm 波长下比色。

1.3.4 赖氨酸含量计算。赖氨酸含量的计算公式如下：

样品中赖氨酸的含量（%）=[（从标准曲线上查得值，μg/mg）×10-3/（样品质量，mg）]×q×100%-C。式中：q为校正系数，q=1.151 5；C为样品中游离氨基酸含量（%）。

1.4 数据处理

将所得籽粒赖氨酸的数据，利用SAS2020 进行相关统计分析[19]。采用Excel 2019 进行数据初步分析，用SPSS28.0 统计软件，对参试青稞材料籽粒赖氨酸含量进行系统聚类分析[20]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

用紫外分光光度计在530 nm 波长下测定溶液的吸光度，结果见图1。由图可知，在530 nm 可见光波长下的吸光度呈现良好的线性关系：y=0.016x+0.035 9，决定系数R2=0.993 5。表明用此方法测得的青稞籽粒赖氨酸含量试验准确性高。

图1 赖氨酸含量的标准曲线

2.2 不同青稞材料籽粒赖氨酸含量的分布

从图2 中可以看出，青稞材料的赖氨酸含量在0.300%～0.550%分布最多，约占总青稞材料的85.0%。表明供试的青稞材料籽粒赖氨酸含量变异较大，呈正态分布。

图2 青稞籽粒赖氨酸含量的频率分布

由表2 可知，供试的青稞材料籽粒赖氨酸含量差异具有高度统计学意义（P＜0.01）。

表2 不同青稞材料籽粒赖氨酸含量的方差分析

2.3 不同来源地青稞材料间赖氨酸含量的差异

在166 份青稞材料中，对4 个不同地区间青稞籽粒赖氨酸含量进行方差分析，结果见表3。除了四川与甘肃的差异具有高度统计学意义（P＜0.01）外，其他省份（自治区）间差异均无统计学意义。表明四川与甘肃地区青稞籽粒赖氨酸含量差异大。

表3 不同地区青稞籽粒赖氨酸含量之差异

通过对不同地区青稞品种赖氨酸含量进行统计，比较4 个不同地区166 份材料（表4）。不同地区青稞材料的赖氨酸含量均值变化趋势为四川＞西藏＞青海＞甘肃，赖氨酸含量的总平均值是0.446%，总变异系数为20.88%，其中西藏的变异系数最高，为20.63%，小于总体变异系数。赖氨酸含量最小值是0.275%（白青稞）。从赖氨酸含量变化幅度来看，不同来源地青稞材料的赖氨酸含量变异性相似。因此，青稞大麦品种资源籽粒中的赖氨酸含量受品种遗传性状及产地地理位置、气象条件及栽培措施等因素的综合影响。

表4 青稞材料籽粒赖氨酸含量的表型分布

2.4 青稞籽粒赖氨酸含量的聚类分析

对供试材料赖氨酸含量数据处理之后，进行系统聚类分析，结果如图3，将166 份青稞籽粒品种聚类为4 大类群，遗传距离定为0.126 处（表5）。第Ⅰ类群包括1 份赖氨酸含量高的青稞品种（系），来自西藏朗县（长芒白青稞），其赖氨酸含量为0.834%。第Ⅱ类群包括6 份赖氨酸含量较高的青稞品种（系），赖氨酸平均含量为0.688%，变幅为0.649%～0.744%，其中西藏2 份、四川1 份、青海3 份，这类群供试材料变异系数为4.92%，主要来自青海地区。第Ⅲ类群包括58 份赖氨酸含量较低的青稞品种（系），赖氨酸平均含量为0.353%，变幅为0.275%～0.403%，其中西藏29 份、四川5 份、青海19 份、甘肃5 份，这类供试材料变异系数为10.66%，主要来自西藏地区，占50%。第Ⅳ类群包括101 份赖氨酸含量低的青稞品种（系），赖氨酸平均含量为0.479，变幅为0.407%～0.611%，其中西藏54 份、四川22 份、青海22 份、甘肃3 份，这类供试材料变异系数为10.67%，主要来自西藏地区，占53%（表6）。所有供试材料籽粒赖氨酸含量的平均值为0.446%，变异幅度为0.275%～0.834%，其中：来自西藏朗县的长芒白青稞（编号：35）含量最大，为0.834%；西藏八宿的白青稞（编号：13）含量最小，为0.275%；青稞籽粒赖氨酸含量最大值达最小值3 倍以上。据此选出长芒白青稞、昆仑10 号、白六棱、米如红、紫青稞等9 种青稞籽粒赖氨酸含量＞0.6%的品种和10 种青稞籽粒赖氨酸含量＜0.6%的较低品种（表7）。

图3 166 份青稞材料赖氨酸含量的聚类分析

表5 聚类分析四大类青稞籽粒赖氨酸含量的表型分布

表6 不同地区青稞材料在各类群中的数量

表7 含量较高和较低赖氨酸种质材料

通过聚类分析，依据赖氨酸含量将166 份青稞材料划分成四大类，根据不同类青稞品种赖氨酸含量进行方差分析，比较不同类的166 份材料（表8）。第Ⅰ类群、第Ⅱ类群与第Ⅲ类群、第Ⅳ类群差异有高度统计学意义（P＜0.01）；第Ⅲ类群与第Ⅳ类群差异也有高度统计学意义（P＜0.01）。

表8 不同聚类类别青稞籽粒赖氨酸含量差异

3 讨论与结论

程晓彬等分析了康青3 号、康青5 号、康青6号、康青7 号、康青8 号、康青9 号、康青10 号共7 个品种籽粒赖氨酸含量，其含量均较低[14]。原红军等分析表明，西藏青稞赖氨酸含量在0.31%～0.79%，变异系数为6.37%[21]。刘婷婷等对青稞氨基酸进行了测定与评价，赖氨酸含量平均为0.367%，评分高于小麦、粳米、玉米和小米[23]。Huang 等分析了来自西藏不同县的245 份材料籽粒赖氨酸含量，平均为0.39%[27]。侯殿志等研究了29 种西藏青稞品种籽粒赖氨酸含量的变异，含量在0.32%～0.43%[22]。报道还显示，青稞氨基酸含量地方品种高于育成品种[24]。而在本研究166 份青稞供试材料中，赖氨酸的质量分数最大值为0.834%，最小值为0.275%，平均值为0.446%，高于上述研究。有研究认为，青稞籽粒赖氨酸含量受环境生态气候因子影响，最优关键高原生态气候因子是日平均气温≥0 ℃、积温≥10 ℃积温和年降雨量[25]，主要环境因素是土壤全氮含量、年均日照时数、年均降雨量、年均相对湿度和8 月平均降雨量[26]，所以本研究中赖氨酸平均含量较高的影响因素可能是环境和遗传因素。

依据籽粒赖氨酸含量进行聚类分析，将青稞品种划分为4 类：第Ⅰ类赖氨酸含量0.834%，为赖氨酸含量最高的青稞品种；第Ⅱ类赖氨酸含量较高，在0.649%～0.744%，赖氨酸青稞品种占样品总数3.61%；第Ⅲ类赖氨酸较低，含量在0.275%～0.403%，占供试样品总数34.94%；第Ⅳ类赖氨酸含量在0.407%～0.611%，占样品总数60.84%。对不同地区青稞籽粒赖氨酸含量进行方差分析，得出四川与甘肃地区的差异具有高度统计学意义（P＜0.01）；将供试材料进行聚类分析分成4 大类群，方差分析得出第Ⅰ、Ⅱ类群与第Ⅲ、Ⅳ类群差异具有高度统计学意义（P＜0.01）；第Ⅲ类群与第Ⅳ类群差异也有高度统计学意义（P＜0.01）。说明以上分类可靠。

来自西藏的青稞供试材料为86 份，赖氨酸含量在0.407%～0.834%，该地区青稞材料赖氨酸含量普遍较高的共有57 份，占66.28%，这可能与当地气候条件有关，该现象表明西藏地区可能有进行赖氨酸功能性研究的良好材料，同时能够为赖氨酸的基础性研究提供理论依据。马得泉等参照国外有关标准和国内小麦标准，认为大麦籽粒赖氨酸含量≥0.5%为高赖氨酸优质资源[13]。按照相关标准，本次供试材料166 份中，大麦籽粒赖氨酸含量≥0.5%的共有40 份（表9），按聚类分析，其中第Ⅰ、Ⅱ类赖氨酸含量为0.649%～0.834%，共有7 个品种，分别是长芒白青稞、白六棱、紫青稞、昆仑10 号、青稞、米如红、昆仑3 号细选。

表9 40 份青稞种质赖氨酸含量（质量分数）

通过聚类分析，不仅为划分不同品种的青稞籽粒赖氨酸含量提供参考，并且本研究筛选出的高赖氨酸材料为青稞品种选育及栽培提供了有利依据。