四逆汤通过自噬途径对脓毒症大鼠左心室功能的影响∗

江四华，代卓青，刘 田，宋国林

1 贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000； 2 贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003

脓毒症是指因宿主对感染的反应失调进而导致危机生命的器官功能障碍。流行病学调查显示，脓毒症心功能不全者病死率达70%～90%［1-3］。四逆汤源自《伤寒论》，由炙甘草、附子及干姜组成，四逆汤具有强心扩冠、抗休克、改善心肌能量代谢障碍、调节免疫等作用［4-5］。自噬是细胞自我吞噬，将坏死的蛋白质、残留的细胞器、细胞内细菌病毒进行降解和回收的一个循环过程。有研究［6］发现，在脓毒症的病理生理过程中可以观察到自噬水平发生变化，自噬在脓毒症心功能障碍的发生发展中扮演重要角色，目前对自噬的检测主要推荐LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62/SQSTM1等蛋白指标。

1 材料

1.1 动物SPF 级SD 大鼠，雌性，体质量200～250 g，由湖南长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物实验合格证号：SCXK（湘）2014-0011。检疫后送贵州中医药大学花溪校区动物试验中心饲养。

1.2 主要试剂6-氨基-3-甲基嘌呤（批号：5152-23-4）、一抗（批号：bsm-33309m）均由鼠抗MCE 公司提供。二抗：山羊抗兔IgG（北京中杉公司，批号：ZB-2301）。中药材产地：制白附子四川、干姜贵州、甘草甘肃；制白附子、干姜由贵阳济仁堂中药饮片厂提供，甘草由四川千方中药股份有限公司提供。

1.3 主要器材Vevo 2100 心脏超声机（Visualsonics）。

1.4 中药制备四逆汤中附子（先煎）45 g，干姜27 g，甘草18 g，按照5∶3∶2比例配置，加水500 mL，煎煮150 mL（药物浓度0.5 g/mL）［7-8］。

1.5 实验方法

1.5.1 大鼠脓毒症模型制备方法［9］采用盲肠结扎穿刺法造模。大鼠腹腔内注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉成功后将SD 大鼠仰面固定在鼠板上，沿腹壁正中（3 cm×3 cm）处刮毛、消毒、铺巾，腹壁正中切开2 cm，拉出盲肠后在盲肠总长度50%处结扎，用国产25 号针头在结扎线下5 mm处贯穿盲肠1次，造成2个漏口，回纳盲肠后关腹，术后皮下注射生理盐水（5 mL/100 g）复苏。造模成功标准：大鼠出现精神萎靡不振、竖毛、嗜睡、眼鼻渗血、拉稀等脓毒症表现。见图1。

图1 SD大鼠造模情况

1.5.2 分组与给药 将150 只SD 大鼠随机选取30 只作为空白组，其余120 只按盲肠结扎穿刺法造模，将造模成功90 只大鼠按随机数字表方法分为实验组、对照组、阻断组各30 只。再将每组随机分为8、16、24 h各10只。

实验组按1 mL/100 g 灌胃四逆汤，每隔8 h灌胃1 次（如取材时间与服药时间重复，则服药时间提前2 h）。空白组、对照组：按1 mL/100 g 灌胃生理盐水，每隔8 h 1 次。阻断组：四逆汤灌胃剂量、方法同实验组，再按15 mg/kg 腹腔注射3-MA［10］。

1.5.3 心脏超声数据采集 将SD 大鼠腹腔内注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg）麻醉成功后使用电动剃毛刀刮去SD 大鼠胸前区（8 cm×8 cm）毛发，再涂上脱毛膏，3～5 min 后用纱布擦净脱毛膏，并将SD 大鼠固定在鼠板上，使胸前区充分暴露于心脏探头下，打开Vevo 2100 心脏超声机，使用心脏探头检测大鼠8、16、24 h心脏不同切面数据。评价左心室收缩末期容积（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室舒张末期容积（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、心输出量（cardiac output，CO）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5.4 心肌自噬蛋白P62、LC3-I、LC3-Ⅱ检测 分别于干预8、16、24 h 取出各组大鼠心肌组织，采用BCA 法进行蛋白定量分析，每孔取50 μg 蛋白上样，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用湿式电转移法将目的蛋白转移至PCDF 膜上，5%脱脂奶粉温室封闭4 h，洗膜后加入一抗（稀释1∶1000）室温下3 h。再次洗膜，加辣根过洗膜后于暗室内加入显影剂并曝光扫描，采用凝胶成象系统分析图象（Blo-RAO Gel Doc 2000），计算光密度值（OD值），重复3次。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用单因数方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LVEDV、LVESV、CO与LVEF1）干预8 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF 实验组均高于对照组（P＜0.05）；对照组与阻断组比较，LVEDV 无显著性差异，LVESV、CO 低于对照组（P＜0.05），LVEF高于对照组（P＜0.05）。2）干预16 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF实验组均高于对照组（P＜0.05）；对照组与阻断组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3）干预24 h：各组大鼠LVEDV、LVESV、LVEF 差异均无统计学意义（P＞0.05）；实验组CO 高于对照组（P＜0.05），对照组CO与阻断组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图2。

表1 各组SD大鼠不同时间左心室心功能比较（xˉ±s）

图2 各组SD大鼠心脏彩超

2.2 心肌自噬蛋白表达

2.2.1 LC3-I与LC3-Ⅱ 实验组干预8、16 h自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ表达强于对照组（P＜0.05），对照组与阻断组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；24 h 各组LC3-I、LC3-Ⅱ表达差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠不同时间心肌组织LC3-I、LC3-Ⅱ与P62/SQSTM1表达（xˉ±s） μg/mL

2.2.2 P62 实验组干预8 h P62 表达与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），阻断组P62表达高于对照组（P＜0.05）；干预16 h，P62蛋白表达实验组低于对照组（P＜0.05），对照组高于阻断组（P＜0.05）；干预24 h，P62 蛋白表达实验组高于对照组（P＜0.05），对照组高于阻断组（P＜0.05），见表2。

2.2.3 自噬蛋白表达与四逆汤干预 实验组大鼠心肌自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ在16 h表达最强，24 h 后降低，对照组、阻断组总的趋势是逐渐下降。实验组大鼠心肌自噬蛋白P62 总的趋势是先下降后上升，在16 h 蛋白表达最低，对照组、阻断组16 h蛋白表达最强，24 h后降低。从试验结果可以看出，在四逆汤的干预下，自噬蛋白表达符合正常自噬调控时间由线，见图3—4。

图3 自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ与P62表达

图4 四逆汤干预下自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ与P62表达

3 讨论

脓毒症导致的多器官功能障碍是死亡的主要原因之一，尤其心功能障碍中左心室功能障碍占大多数，然而，脓毒症合并左心室功能障碍的机制仍不清楚，对其治疗仍有不足。

目前，评价左心室功能运用最广泛的是超声心动图，不仅可评价左室整体收缩功能，还可评价左室舒张功能和局部心肌运动［11］，其中LVESV、LVEDV、CO、LVEF 是评估左心室收缩功能的常见指标。干预8、16 h实验组LVESV、LVEDV、CO、LVEF等均优于对照组、阻断组。说明四逆汤能够缓解脓毒症SD大鼠左心室收缩功能。干预24 h，除CO外其余指标各组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。而实验组CO 高于对照组、阻断组（P＜0.05），这可能与脓毒症SD大鼠每搏量及心率变化有关。

自噬是是维持细胞内环境自稳的一种自我保护机制。据相关研究显示，检测自噬蛋白P62、LC3-Ⅰ/Ⅱ表达可以反映自噬参与脓毒症与心功能障碍的调控水平［12-13］。

LC3 又被称为微管相关蛋白1 轻链3，主要功能是促进自噬小体体积增大，识别并包裹自噬底物，因此作为自噬起始标志物，最具代表性［14］。研究发现盲肠结扎穿刺法诱导的脓毒症小鼠中自噬LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白在造模后4～6 h 开始增加，在CLP 术后12～18 h 自噬被充分激活，达到最高峰，24 h 自噬恢复最初水平；也有研究显示在盲肠结扎穿刺术后24 h 自噬未完全消失，说明自噬调控具有时间性，出现这两种不同结果的原因可能是组织标本采集时间不一［15-17］，本研究结果基本符合自噬调控时间曲线。

在自噬过程中，P62 不仅是自噬蛋白，还是自噬底物，能使LC3 与多聚泛素化蛋白连接，通过泛素信号通路将受损的细胞器或蛋白转运到自噬体中，最终被降解［18］，当自噬激活时，P62 在细胞内持续降解，其表达量相应减少，自噬抑制时P62 逐渐在细胞内累积，其表达量增加［19］，故自噬蛋白P62 表达量与自噬活性呈负相关［20］。理论上24 h自噬消失，实验组、阻断组、对照组自噬P62 蛋白表达一致，而本研究实验组表达最强，对照组、阻断组表达最低，可能与自噬滞留有关，因为自噬是一个复杂过程，受多种信号通路调控，24 h 对照组、阻断组可能存在自噬滞留现象，故出现对照组、阻断组自噬蛋白P62 表达降低现象。本研究结果显示，P62蛋白的表达基本符合自身调控规律。

综上所述，四逆汤可通过自噬途径调控脓毒症SD大鼠左心室功能，而且在16 h自噬活性最高，该结果可为临床四逆汤何时介入治疗提供参考。