生姜治疗阿尔茨海默病作用机制网络药理学分析∗

王 斌，曾庆涛，王雅乐，黄 海，许 苗，吴红彦

深圳市罗湖区中医院，广东 深圳 518000

生姜Acorus tatarinowii Schott，为天南星科属干燥的根和茎。主产于四川、浙江、江苏。秋冬二季采挖，除去须根及泥沙，《神农本草经》［1］中，被列为上品，晒干，生用，“主风寒湿痹，咳逆上气，开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出音声。”药性：辛、苦，温。归心、胃经。功能：开窍豁痰，醒神益智等。现代药理研究发现，生姜具有改善记忆、认知的功能［2］。因此，探究其改善记忆、认知的机制，可更深层次挖掘其潜在的药用价值。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性、进行性、衰退性不可逆转的神经性系统疾病［3］，主要表现为认知、记忆力下降等症状，全球大约有5000 万老年人因AD 生活质量受到严重影响［4］。据报道全球痴呆症经济成本，包括直接医疗、直接社会部门和非正规医疗费用预计到2030年将增至2万亿美元［5］。

AD发病机制尚未阐明，1992年哈代和希金斯［6］首次提出了淀粉样级联假说的病因β-淀粉样蛋白。目前认为，β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）的沉积与Tau 蛋白过度磷酸化有一定关联，包括炎症、免疫、神经元死亡和特异性神经递质减少等相关病理过程［7］。近年来，药物治疗主要以胆碱酯酶抑制剂为主［8］，但效果不理想。因此，探寻高效低毒药物已成为AD领域亟需解决的热点问题之一［9］。

英国药理学家Hopkins 2007 年提出的“网络药理学”，以系统生物学、基因组学、药理学、转录组学等为基础［10］。可从分子、生物、基因网络角度系统地、全方位、多层次地揭示中药治疗疾病的机制［11］。本研究通过构建药物-靶点-AD 网络图，较直观呈现出药物、靶点和疾病之间的关联性，并进行相关系统分析［12］，旨在更深层次探究生姜防治AD的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 生姜活性成分及作用靶点获取和筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［13］，检索“生姜”活性成分，并参考已报道文献［14］，设置筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，筛选生姜主要活性成分，并从知网、PubMed数据库加以补充。运用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）［15］和数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），设置物种为“人类”，将靶点转换为相应基因名称。

1.2 AD 靶点网络构建运用在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）、人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）等检索AD靶点，以“Alzheimer's Disease”为关键词，获得AD 基因，整理剔除重复基因，收集AD 靶点。通过R 软件将生姜活性成分和AD 靶点取交集，得到生姜治疗AD的靶点，绘制韦恩图。

1.3 药物-靶点-疾病网络构建运用Cytoscape［16］软件（http：//www.cytoscape.org）中的插件“network analyzer”，对分子-靶点网络特征参数进行分析［17］，图中节点（Node）代表药物与靶点；边（Edge）代表药物、靶点、疾病之间的关联。

1.4 蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interactions，PPI)构建将生姜治疗AD 的潜在靶点输入STRING（https：//string-db.org）［18］中，限定物种为“Homo Sapiens”，获取靶点，设置最低阈值，设为“medium confidence”，隐藏散在游离靶点，其他参数值设定为默认值，以txt文件保存，得到蛋白间网络模型。运用Network Analyzer获得中介度（betweenness centrality）和连接度（degree）等参数对模型进行预测分析［19］。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析运用Bioconductor生物包，通过R软件，安装相关生物包，便于分析GO 功能。ClusterProfiler 包是R 软件基因数据分析包之一，可搜索Bioconductor 提供的GO功能和KEGG数据库进行富集分析，其可视化功能特点突出。运用该软件，以P＜0.05 为筛选条件，并将得到的结果可视化处理［20］。

2 结果

2.1 生姜活性成分及作用靶点通过TCMSP 筛选到生姜活性成分105个，潜在活性成分5个。见表1。

表1 生姜活性成分

2.2 生姜活性成分治疗AD的潜在作用靶点共得到AD与药物共同靶点60个，见图1。

图1 药物与AD靶点交集图

2.3 药物-靶点-AD 网络药物主要活性成分与关键靶点的相互作用关系共33 个。通过Degree和BC 值大小，筛选核心靶点［21］，结果IL-6、Akt1、JUN、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT 等靶点是整个网络的核心节点，揭示这些节点可能是生姜治疗AD 的有效成分或靶点。见图2、表2。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络图

表2 药物-靶点-AD网络关键节点及其拓扑学特征

2.4 生姜治疗AD关键靶点登陆STRING，导入生姜治疗AD的靶点，将筛选条件设置为＞0.9，将单个游离的蛋白隐藏，得到PPI 图。节点（node）共60个，平均值12.9，边（edge）388 条。边数（edge）越多，表示该节点（node）对应的靶点在网络中的作用越重要［22］。通过R 软件，收集靶点信息条形图，结果Akt1、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT、IL-6、JUN 等蛋白度值较高，表明该蛋白作用显著，也是其他蛋白互通的纽带。见图3—4。

图3 关键靶点PPI网络

图4 关键靶点信息条形图

2.5 GO 功能及KEGG 通路分析GO 揭示，生姜治疗AD 的关键靶点排名前10 的生物学功能主要包括肽结合（12 个靶点）、酰胺结合（12 个靶点）、核受体活性（8 个靶点）、配体激活转录因子活性（8个靶点）、血红素结合（8 个靶点）、四吡咯结合（8个靶点）、DNA 结合转录因子结合（8 个靶点）、RNA聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合（7 个靶点）、泛素样蛋白连接酶结合（6 个靶点）等，显示生姜可通过调控多个复杂的生物信息学、基因组学以及抑制转录进程来治疗AD。通过KEGG 分析获得135 个通路，以P＜0.05 设置筛选条件，对核心KEGG进行分析，获得5条主要信号通路，主要集中在AGE/RAGE（13个靶点）、TNF（12个靶点）、IL-17（9 个靶点）、C-type lectin receptor（10 个靶点）、Toll 样受体（9 个靶点）等信号通路上。见图5—6。

图 6 KEGG富集分析

3 讨论

本研究发现，beta-sitosterol、6-methylgin gediacetate 2、Stigmasterol、poriferast-5-en-3beta-ol、Dihy-drocapsaicin等为生姜主要活性成分。beta-sitosterol（β-谷甾醇）可降低逆转APP/PS1小鼠海马神经元兴奋性突触后电流频率，表明β-谷甾醇可改善记忆、学习障碍及运动障碍，同时可能降低Aβ沉积［23］。有研究［24］发现Dihydrocapsaicin 可减少AD 活性氧和炎症，提示辣椒素可通过调节活性氧和炎症对APP的额外和潜在不良影响加工与加工β稳态，在体内对AD起防治作用。

活性氧介导的氧化修饰Akt1 有助于突触AD的功能障碍，视为失去对突触可塑性至关重要的活性依赖性蛋白质翻译和维护，而促进突触上Akt1-mTOR 信号传导的治疗策略可能提供新的治疗方法，成为抗氧化酶疾病的治疗靶点［25］。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）又称为活化蛋白激酶，MAPK8 是MAPK 家族成员之一，又被称为c-Jun 氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1），通过磷酸化并激活转录因子以进一步激活相应子蛋白1（activator protein-1，AP-1），促使下游相关基因表达，在细胞（分化、增殖、生存、死亡）、炎症等病理发生、发展过程中起调控作用［26］。CASP3 又称为半胱氨酸蛋白，是Caspase 蛋白家族中的成员之一，一般情况下是以非活化酶原形式存在，Caspase-3 一旦激活，将会引起神经系统相关疾病，如阿尔茨海默病、脑膜炎等［27］。

KEGG揭示，IL-17通路与炎症的发生关系密切，IL-17 为受体家族，主要由IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC 等组成，研究发现AD 患者体内IL-17 表达升高［28］。Toll 通路又称为（Toll-like receptors，TLR）TLR，是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类比较重要的蛋白质分子之一，同时也是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁，研究发现［29］Aβ可激活的小胶质细胞，将免疫监视模式转化为免疫应答模式，使产生的IL-6、TNF-α及其他神经毒性因子，阻断Toll信号通路，减少了相关促炎因子的产生。

综上所述，通过网络药理学方法探究生姜治疗AD的作用机制［30］，结果显示涉及多个活性成分、靶标及多个相关通路［31］，与中药治疗AD 多靶点特点切合［32］，可为中药药效物质基础及药理机制研究提供新思路、新方法［33］。