益气养阴方联合电针对产后压力性尿失禁大鼠CXCR4/COX-2 信号通路的影响∗

徐 静，王 旭，房桂英，黄丽霞，魏旭静

河北医科大学第一医院妇产科，河北 石家庄 050051

压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指在打喷嚏、咳嗽等运动时，腹部压力增高而出现的尿液不自主经尿道外口漏出的现象［1］。产后压力性尿失禁（postpartum urinary incontinence，PPUI）是指在妊娠和分娩后，产妇出现的SUI 现象，PPUI 在产妇中的发病率达60%以上，给产妇的身心健康和生活质量带来严重影响［2］。SUI的发病机制较为复杂，有研究发现妊娠生理期会增加腹部压力，减少盆底支持结构胶原，同时分娩会损伤产妇盆底神经、肌肉和筋膜，导致盆底支持组织松弛，进而导致SUI［3］。目前临床治疗SUI 多采用无张力吊束带，此方法仅为物理作用，无组织结构和功能方面的根本改善，不能恢复骨盆肌肉和尿道肌肉收缩强度，效果不理想［4］。近年中医药辅助治疗SUI效果已得到证实［5］，但益气养阴方治疗SUI 的研究尚未见报道。中医临床常用针灸治疗SUI疗效较好［6］。有文献证实，电针可有效降低SUI患者漏尿量，漏尿患者可从64.4%降低至14.4%以下［7］。环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是COX-2的亚型之一，多在核膜和微粒体膜中表达［8］。炎症反应时机体COX-2高表达。有研究发现COX-2存在于多种组织中，例如生殖系统、肠胃、尿道组织等，有调控人体下尿路的功能［9］。基质细胞衍生因子（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其趋化因子受体4（chemokine receptor 4，CXCR4）构成了SDF-1/CXCR4 轴，对干细胞归巢有一定调控作用［10］。CXCR4 在多种组织细胞中均有表达，但CXCR4 在膀胱和尿道组织中的表达尚不明确。本研究旨在探究益气养阴方联合电针对PPUI 大鼠CXCR4/COX-2信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级大鼠150 只，120 只为雌性未生产大鼠，30 只为雄性大鼠；大鼠体质量为220～240 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。普通饲料喂养大鼠7天以适应新环境，室温保持在25 ℃左右，室内光照仿昼夜交替，12 h 一循环，自由进食摄水。

1.2 试剂与仪器上海中医药大学中药制剂室调制的益气养阴方，主要由党参15 g，玄参15 g，黄芪20 g，天花粉20 g，熟地黄10 g，炒山药10 g，覆盆子10 g，麦冬10 g，知母10 g，肉桂2 g，鹿茸3 g 组成，将药材分别加水煎煮2 次，第1 次加入10～12 倍水，煎煮1～2 h，第2 次加入8～10 倍水，煎煮1～1.5 h，合并2次水煎液，沉淀24 h，滤过，收集滤液；CXCR4抗体和COX-2抗体（购自中国Abcam，货号：ab309219、ab88522）；中性树胶（购自上海博湖生物科技有限公司，货号：S30509，规格：100 g）；YD-6LA 切片包埋机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。

1.3 动物分组与模型制备将120 只雌性大鼠和30只雄性大鼠按照4∶1合笼，1个月后120只雌性大鼠均临产，将120 只临产大鼠分为空白组20只，模型组100 只。大鼠分娩后1 天，将100 只大鼠用乌拉坦腹腔麻醉，仰卧位固定，在大鼠阴道内插入8Fr弗莱氏尿管，深度为2～3 cm，将5 mL 生理盐水注入气囊中，予平行阴道径向压力300 g，8 h后，将水囊导尿管从阴道中取出，制备PPUI 模型。空白组为正常生产大鼠，不予任何处理。

1.4 动物模型鉴定

1.4.1 喷嚏实验 在大鼠膀胱中插入硬膜外导管，并将含美蓝的生理盐水注入到膀胱内，当看到尿道外口有蓝色液体漏出时记录大鼠最大膀胱容量，排空膀胱，将最大膀胱量一半的美蓝生理盐水再次注入膀胱内；剪下大鼠鼠须，将其伸入到大鼠鼻孔内制造大鼠喷嚏反应，当大鼠尿道口有蓝色液体流出时记为喷嚏实验阳性；当大鼠尿道口没有蓝色液体流出时记为喷嚏实验阴性，统计大鼠喷嚏实验阳性数量。

1.4.2 尿动力学检测 将导管插入各组大鼠膀胱内，用尿动力学检测仪测定各组大鼠尿动力。各组大鼠排空膀胱，将含美蓝的生理盐水用微量泵注入膀胱内，速度保持在每小时10 mL，记录尿道口出现第一滴尿液的时间与此时的膀胱内压力。最大膀胱容量=10 mL/h×时间，此时膀胱内压力为漏尿点压力，重复3次，取平均值。

1.5 动物分组与药物干预造模成功大鼠共计75只，按随机数字表法分为PPUI组、益气养阴组、益气养阴+电针组，每组25 只。益气养阴组大鼠灌胃1 mL/100 g益气养阴汤剂，连续8周；益气养阴+电针组大鼠灌胃1 mL/100 g 益气养阴方汤剂后给予无菌针灸针直刺大鼠双侧肾俞穴15 mm，斜刺入会阳穴20 mm，将电子诊疗仪和双侧针柄相连接，电压3.6 V，频率1 Hz，波长20 ms，串长2 s，每周电刺激2 次，共8 周。其中空白组和PPUI 组大鼠仅灌胃等量生理盐水，共8周。

1.6 盆底肌肉肌力检测测定各组大鼠建模后1 天及1、2、4、8 周时的单收缩最大肌张力。固定各组大鼠，游离耻尾肌体部，保证大鼠供血完整。切断大鼠耻尾肌肌腱，用肠线将肌腱和张力换能器相连接，连接线始终处于水平状态。用铂金双极刺激电极直接刺激支配神经，刺激位置为距离入肌点2 mm 处，调整肌肉最适初长度和阈上刺激电压，记录单收缩最大肌张力。测试后称量耻尾肌重量，计算各组盆底耻尾肌单刺激收缩力与肌重比值。

1.7 血清生化检测建模8周后，取各组大鼠眼底血管内全血8 mL，将全血静止1 h，离心半径10 cm，8000 r/min 离心10～15 cm，去上清，用全自动生化分析仪检测血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）与肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量。

1.8 肛提肌组织病理学变化处死各组大鼠，取盆底两侧耻尾肌组织制成石蜡切片，用伊红-苏木染色，将切片组织经脱水、透明后用中性树胶封片，用显微镜观察盆底耻尾肌病理变化。

1.9 尿道组织CXCR4、COX-2 蛋白检测（蛋白印迹法）每组取大鼠5 只，取尿道组织，用眼科剪剪碎后提取总蛋白。先制备SDS 聚丙烯酰胺凝胶，在孔板的每个孔内分别加入50 μg蛋白样品，加压跑电泳，当孔板底部铺满蛋白样品时停止加压，1 h内将蛋白样品全部转移到PVDF膜上，用脱脂奶粉室温封闭蛋白样品2 h；用加入一抗浸泡蛋白样品，4 ℃环境孵育过夜，清洗蛋白后用发光显色液对蛋白样品显色。

1.10 统计学方法采用SPSS 15.0 软件分析数据，计量资料以xˉ±s表示，用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型鉴定与尿动力学测定造模结果显示共有75 只大鼠喷嚏实验呈阳性，且尿动力出现异常，模型制备成功，成功率为75%。与空白组相比，最大膀胱容量和漏尿压力点PPUI组均降低（P＜0.05），益气养阴组和益气养阴+电针组升高，益气养阴+电针组升高效果更明显（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠尿动力学指标比较（xˉ±s）

2.2 大鼠盆底肌肉肌力比较干预1 天时，PPUI组、益气养阴组和益气养阴+电针组大鼠收缩力/肌力比值无显著变化（P＞0.05）；与空白组相比，在干预2、4 和8 周时大鼠收缩力/肌重比值PPUI组降低（P＜0.05），益气养阴组和益气养阴+电针组较PPUI 组增加，且益气养阴+电针组增加更明显（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠盆底肌肉收缩力/肌重比值比较（xˉ±s）

2.3 大鼠血清生化指标比较LDH、CK 含量PPUI组较空白组升高（P＜0.05），益气养阴组和益气养阴+电针组较PPUI 组降低（P＜0.05），且益气养阴+电针组降低更明显（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠LDH、CK含量比较（xˉ±s） U/L

2.4 大鼠肛提肌组织病理学变化与空白组相比，PPUI 组大鼠肛提肌较肥大，肌纤维组织排列不规则，部分细胞横街面积不一致，有萎缩细胞、肥大细胞出现，肌纤维大量坏死；与PPUI 组相比，益气养阴组和益气养阴+电针组大鼠肌纤维组织改善明显，肛提肌纤维排列较紧密，肌纤维仅有少量坏死，无变性；益气养阴+电针组大鼠肛提肌组织较益气养阴组改善较显著。见图1。

图1 各组大鼠肛提肌组织病理学变化（HE，×400）

2.5 大鼠尿道组织CXCR4、COX-2 蛋白表达与空白组相比，PPUI 组CXCR4 蛋白减少，COX-2 蛋白增多（P＜0.05）；益气养阴组和益气养阴+电针组CXCR4 蛋白较PPUI 组增多，COX-2 蛋白较PPUI 组减少（P＜0.05）；且益气养阴+电针组CXCR4 蛋白表达高于益气养阴组，COX-2 蛋白低于益气养阴组（P＜0.05），见图2—3。

图2 各组大鼠尿道组织中CXCR4、COX-2蛋白表达

图3 各组大鼠尿道组织中CXCR4、COX-2蛋白表达柱状图

3 讨论

有研究显示，90%以上的SUI 属解剖型尿失禁，主要为盆底肌松弛所致，一般在妊娠后阴道分娩时发生损伤，以及绝经后雌雄激素水平降低等导致［11］。盆底支持结构损伤，导致膀胱近端尿道从盆底脱出，咳嗽时腹腔内压力不能均匀传递到膀胱和近端尿道，膀胱内压力大于尿道内压力，导致漏尿［12］。美国泌尿学会研究发现，手术治疗对多数SUI 长期有效，但手术会给患者带来创伤，并且术后会发生尿急、尿困难等风险［13］。有专家建议，轻度和中度尿失禁患者首选非手术治疗［14］。药物治疗SUI 不仅可减轻漏尿次数，还可提高患者生活质量，目前常用的药物有α1肾上腺素受体激动剂米多君等，不仅费用高，用药后会出现较多不良反应，患者难以接受［15］。中医将其归为“小便不尽”“遗尿”等范围，多为肾气虚弱，膀胱不固，治疗应补肾固摄。中医学认为盆腔器官脱落为“阴挺”，主要发病机制为气虚下陷，治疗应益气升提，补中固脱。产妇生产后一般气血亏虚，肾气不固，膀胱失约，进而导致遗尿，治疗应培补肾气、固摄膀胱［16］。根据“经脉所过，主治所及”理论，经络穴位可治疗经络循行部位病证，因此本研究取鼠双侧肾俞穴和会阳穴。本研究发现PPUI 组大鼠最大膀胱容量和漏尿点压力降低，益气养阴+电针组升高。有研究［17］证实，PPUI 组大鼠最大膀胱容量和腹压漏尿点压力降低，益气养阴+电针组提升，与本研究结果一致。

女性生理性控尿由尿道括约肌和骨骼肌的自主收缩完成，进而对盆腔内脏器提供长久支持。当肛提肌发生损伤，腹部压力突然升高，膀胱压力超过尿道压力，进而导致压力性漏尿［18］。本研究中PPUI 组大鼠收缩力/肌力比值降低，益气养阴+电针组高于PPUI 组。尿失禁发生时肌肉收缩功能下降，可见益气养阴+电针对产后尿失禁有明显改善作用，益气养阴+电针可通过增加盆底肌肌肉收缩功能起改善主动控尿的作用机制。肌肉发生损伤时，血清LDH 和CK 会发生一定变化。本研究结果显示，PPUI 组大鼠血清LDH 和CK 含量高于空白组，可见受长期压力作用，损伤大鼠盆底肌肉群，增加膜的通透性，进而外漏了部分胞内酶；益气养阴+电针组血清LDH 和CK 含量被抑制。益气养阴方中党参和黄芪补中益气；肉桂和麦冬养阴生津；覆盆子和鸡内金健脾利湿，收涩缩脲；鹿茸补肾助阳，能有效增强肾脏利尿功能。关元俞补肾益气，电刺激可增加其疗效，肾气充足，膀胱开阖有度，进而抑制尿液外溢［19］。可见益气养阴方联合电针干预治疗PPUI疗效确切。

有学者对犬类动物研究发现，COX-2 在下尿路中表达，并且催化COX-2产生的PGs产物在下尿路中的分布和性腺状态密切相关［20］。切除动物性腺后，COX-2 在下尿路中呈低表达，进而损伤下尿路功能，可见性腺切除会导致动物尿失禁。CXCR4是SDF-1 趋化因子的特异性受体，研究证实干细胞表面的CXCR4 表达会通过多种因子刺激而增加，进而增加干细胞的归巢能力。本研究结果显示，PPUI组CXCR4蛋白减少，COX-2蛋白增多；益气养阴+电针组CXCR4 蛋白较PPUI 组增多，COX-2 蛋白较PPUI 组减少，可见益气养阴方加电针可降低COX-2表达，增加CXCR4表达，进而对CXCR4/COX-2蛋白表达进行有效调控。LENIS 等［21］研究证实，未生产过的大鼠阴道扩张7 天后，CD193 和CXCR4表达上调，与本研究结果一致。

综上所述，益气养阴方联合电针可提高产后大鼠压力性尿失禁疗效，增加CXCR4 表达，抑制COX-2表达。