基于炎症与糖脂代谢探讨连陈汤对肥胖小鼠体质量的影响∗

王一涵，李佳睿，杜丽坤

1 哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040

肥胖是由遗传、环境等多因素引起的能量代谢紊乱，热量摄入大于消耗所致的营养代谢性疾病。是诱发心血管疾病、高脂血症、高血压、多囊卵巢综合征等疾病的重要危险因素［1］。肥胖的发病受遗传、饮食、肠道菌群、炎症因子等多方面影响［2］。病因虽未完全阐明，但肥胖作为一种慢性低度炎症状态被业界广泛认可［3］。肥胖导致脂肪细胞因子合成异常，可激活炎症信号网络，分解过量游离脂肪酸入血，且脂肪组织前体转化为类巨噬细胞，使炎性因子过度表达与释放，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等［4-5］。研究表明发生胰岛素抵抗（insulin resistant，IR）的重要原因之一是慢性低度炎症的影响［6］，TNF-α、IL-6、MCP-1、C 反应蛋白（C-reaction protein，CRP）等都能导致细胞内炎性反应的发生，激活炎症细胞因子信号，阻断胰岛素信号传导，引发IR［7］。

本研究通过建立肥胖小鼠模型，应用连陈汤与辛伐他汀做对照实验，观察连陈汤对肥胖小鼠体质量、糖脂代谢、附睾脂肪组织的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物本研究选用40 只SPF 级8 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，购于辽宁长生生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001。实验获得黑龙江中医药大学医学与实验动物伦理委员会审批准许（2019071502）；饲养于黑龙江中医药大学药物安全评价中心。

1.2 药品来源药品采购于黑龙江中医药大学附属第一医院。连陈汤药物组成：半夏15 g，黄连6 g，陈皮15 g，茯苓9 g，甘草5 g，加8 倍量水浸泡1 h，文火煎煮2次后合并药液。药液经四层纱布过滤后于70 ℃水浴锅浓缩至含生药0.38 g/mL，高压灭菌后于4 ℃恒温箱保存备用；辛伐他汀片（海正辉瑞制药有限公司，国药准字20010677，规格：20 mg）碾碎后用蒸馏水配制成混悬液保存于4 ℃冰箱中，药物浓度为0.23 mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肥胖模型构建 实验开始前所有小鼠适应性喂养1 周，给予普通饲料且单笼饲养。光照周期：12 h 光照/12 h 黑暗；饲养温度：（25±1）℃；相对湿度：（60±5）%。实验期间小鼠自由进食饮水。1 周后将小鼠随机分为空白组10 只，予普通饲料饲养（黑龙江中医药大学实验动物中心提供）；模型组、辛伐他汀组、连陈汤组各10 只予高脂饲料饲养（派克生物技术有限公司）。连续饲养4个月，每4周称量小鼠体质量1次。高脂喂养小鼠体质量大于空白组体质量的20%即为造模成功。

1.3.2 给药 给药期间饲料喂养方式不变。给药方式和计量：辛伐他汀组灌胃辛伐他汀混悬液［4.5 mg/（kg·d）］；连陈汤组灌胃连陈汤浓缩液［7.47 g/（kg·d）］；空白组与模型组灌胃等体积纯净水。每日1 次，连续4 周，给药期间每周测量小鼠体质量1次。

1.3.3 标本取材 小鼠禁食12 h 后腹腔注射4%水合氯醛水溶液（10 mL/kg）麻醉小鼠，眼球取血，离心后取血清置于-80 ℃环境中保存备用。取血后的小鼠立即置于冰盒上，打开腹腔→剥离完整附睾脂肪组织→冲洗→滤纸吸干→称重→记录数据→置于4%多聚甲醛固定液中固定。

1.3.4 代谢指标检测 使用全自动生化分析仪（日立高科技贸易上海有限公司）检测血清甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）胰岛素水平；尾静脉采血测空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）；计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model of insulin resistance index，HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）/22.5）；使用ELISA检测试剂盒（哈尔滨市盈夏实验仪器经销部提供）检测TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.3.5 附睾脂肪组织HE染色 将4%多聚甲醛固定液中固定的附睾脂肪组织脱水→石蜡包埋→切片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→固封，待通风干燥后于光学显微镜下观察小鼠附睾脂肪组织形态变化。

1.4 统计学方法应用SPSS 21.0 分析数据，计量资料以xˉ±s表示，若符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用tukey 法，不符合正态分布时釆用非参数检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量变化情况饲养16 周时，高脂饲料3组小鼠体质量均高于空白组（P＜0.01）。灌胃4周，空白组小鼠体质量无明显变化；模型组小鼠体质量增加，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；饲养18周时辛伐他汀组小鼠体质量下降，但不如连陈汤组小鼠体质量下降明显；两组比较差异有统计意义（P＜0.05）；饲养17 周时连陈汤组小鼠体质量与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1、图1。

图1 各组小鼠治疗前后体质量变化趋势

表1 各组小鼠体质量变化情况（xˉ±s） g

2.2 小鼠糖代谢水平变化情况与空白组相比，高脂饲料3组小鼠FINS水平、HOMA-IR增高（P＜0.01）。与模型组比较，连陈汤组FINS 及HOMA-IR 水平降低（P＜0.01）；辛伐他汀组FINS及HOMA-IR下降不明显（P＞0.05）。FPG水平模型组高于空白组（P＜0.01）；高脂饲料3组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠FPG、FINS及HOMA-IR比较（xˉ±s）

2.3 小鼠脂代谢水平变化情况与空白组比较，模型组小鼠血脂水平TG、TC 升高（P＜0.01）。与模型组相比，TC、TG 水平连陈汤组和辛伐他汀组均下降（P＜0.01），辛伐他汀组与连陈汤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠TG与TC比较（xˉ±s） mmol/L

2.4 小鼠附睾脂肪组织变化情况空白组小鼠脂肪细胞形态规整；模型组小鼠脂肪细胞体积增大，细胞数量减少，脂滴含量较高；与模型组比较，连陈汤组脂肪细胞体积缩小，脂肪细胞数量增多，脂滴含量下降，辛伐他汀组小鼠脂肪细胞体积与细胞大小略减小但不明显，脂肪细胞数量变化不明显。模型组小鼠的附睾脂肪组织质量高于空白组，连陈汤组小鼠附睾脂肪组织质量较模型组降低（P＜0.01），脂肪积累减少，连陈汤组与辛伐他汀组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 各组小鼠附睾脂肪组织形态（HE，×400）

表4 各组小鼠附睾脂肪组织质量（xˉ±s）g

2.5 小鼠炎症因子变化情况与空白组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.01）；辛伐他汀组血清TNF-α水平降低（P＜0.05）；IL-6、IL-1β水平与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05），连陈汤组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较模型组降低（P＜0.01）；连陈汤组TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于辛伐他汀组（P＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠炎症因子水平比较（xˉ±s） pg/mL

3 讨论

近年来肥胖的发生率逐渐增多且呈年轻化，成为危害健康的公共卫生问题，肥胖是摄入过多或消耗减少导致的脂肪大量累积，血脂代谢紊乱是引起代谢综合征的重要因素之一，尤其内脏脂肪的增加与IR 的发生关系密切［8-9］。白色脂肪会不断扩增，导致TNF-α、IL-6 等水平增高，引起全身性慢性低度炎症状态［10］。研究证实T2DM 的发生发展受肥胖影响，胰岛素抵抗是致病的中心环节［11］。IL-6 在肥胖患者中主要由脂肪细胞分泌，具有促炎活性并使炎症反应加重，降低胰岛素信号转导，引起IR［12］。TNF-α诱导IR 机制有减弱胰岛素引起的葡萄糖跨膜转运、升高血浆游离脂肪酸水平、干扰胰岛素信号传递、抑制产生瘦素和脂联素，使胰岛素信号通路受损等［13-14］，TNF-α与IR程度正相关［15］。郭展宏等［16］研究认为肥胖状态下炎症因子、胰岛素水平会增加，减重后FINS 水平、TNF-α和IL-6水平减低。喻松仁等［17］利用温胆汤干预肥胖大鼠时证实控制体质量的同时TNF-α、IL-6、IL-17 水平会降低（P＜0.01）。吴腾飞等［18］应用苓桂术连汤治疗肥胖伴IR，患者体质量降低的同时TNF-α、IL-2炎症因子降低，HOMA-IR下降。

中医理论下的肥胖最早记载于《黄帝内经》，《素问·奇病论篇》中有“喜食甘美而多肥”的记载，过食肥甘厚味是引起肥胖的因素。连陈汤以《太平惠民和剂局方》中二陈汤为基础方加减而来，以健脾化湿，清热涤痰为原则。方中君药为半夏、黄连。半夏味辛能行散、性燥入脾胃，可消痰逐饮化痰湿；黄连燥湿化痰、除内郁痰热，可制约本方温燥之性；同时半夏配黄连有疏理气机、辛开苦降之功；陈皮理气健脾、燥湿化痰与茯苓健脾利湿使气机得畅，有“治痰先治气”之功；佐以健脾和中的甘草调和诸药。本方配伍得当，共奏健脾化湿功能，起改善体脂、减重抗炎的作用。

本研究表明，高脂喂养的小鼠体质量增加（P＜0.01），其血脂（TG、TC）、炎症因子（TNF-α、IL-6）、FINS 水平以及HOMA-IR 都有升高趋势；附睾脂肪组织的重量也高于空白组（P＜0.01）；HE 染色的附睾脂肪组织可观察到脂肪脂滴增加、形态不均、数量减少。而连陈汤组小鼠体质量下降（P＜0.01），血清TG含量降低（P＜0.01）、TC含量降低（P＜0.05）；TNF-α、IL-6、IL-1β水平及胰岛素抵抗指数降低（P＜0.01）。说明连陈汤可缩小脂肪细胞体积，增加脂肪细胞数量，降低脂滴含量。可见连陈汤可以通过缩小脂肪累积、改善血脂紊乱、降低炎症水平而改善IR。

研究表明连陈汤可改善肥胖患者中医证候积分，改善或者临床症状，降低体质量、BMI、腰围并降低血清TG、TC、LDL-C 水平，改善患者脂质代谢紊乱［19］。连陈汤还可增加肥胖患者肠道菌群多样性，降低厚壁菌门数量，升高拟杆菌门数目，这可能是连陈汤治疗脾虚湿阻型肥胖的作用机制之一［20］。连陈汤可使TNF-α、Chemerin水平有下调趋势可能是治疗单纯性肥胖的作用机制之一［21］。连陈汤可提高肥胖患者Omentin-1 水平、降低IL-6水平，改善FBG、FINS、HOMA-IR 水平，证实其可能通过降低血脂水平、减低慢性炎症反应改善IR［22］。