多指标综合评分优选金荞麦胶囊提取工艺∗

童晓东，马焙焙，彭 敏

南通市中医院/南京中医药大学南通附属医院，江苏 南通 226001

金荞麦为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara 的根茎。别名苦荞麦根、荞麦三七、金锁银开、野荞麦根等，具有清热解毒、排脓祛瘀、软坚散结等功用［1］。南通当地又名铁脚将军草，由南通市中医院已故国医大师朱良春挖掘于民间。1975 年南通市中医院与中国医学科学院药物研究所合作的“新药金荞麦”获得国家级成果（国家二级甲等科技进步奖）。在此基础上研制的金荞麦合剂临床用于治疗急性肺脓疡、喘息型慢性支气管炎、支气管哮喘及急、慢性气管炎等疾病［2-4］。

现代药理研究认为金荞麦主要含有黄酮类、萜类以及酚类等化学成分，主要有（-）表儿茶素-3-O-没食子酸酯、没食子酸、表儿茶素、儿茶素、金丝桃苷、原儿茶酸、原花青素B2、木犀草素等［5］，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌及止痛、清除自由基等药理基础［6-7］。

金荞麦合剂临床应用效果好，但具有保存时间短，不方便携带等缺点，而胶囊则弥补了这些缺点，提高了药物的稳定性，处方和生产工艺也较简便。现在市面上的金荞麦药物以金荞麦为主要药材，以水煎煮，但提取率低。为有效控制金荞麦胶囊中间体的质量，选择优化金荞麦胶囊中间体的制备工艺，以醇提取代替煎煮，以没食子酸、表儿茶素、原花青素B2、儿茶素、原儿茶酸、金丝桃苷、木犀草素等多种主要活性成分为考察指标，对金荞麦的水提、乙醇提取工艺进行正交实验，以多指标成分的检测及浸膏提取率为评分指标，筛选最佳提取工艺。

1 材料

1.1 主要仪器UltiMate3000 高效液相色谱仪、Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Diode Array and Multiple-Wavelength Detectors 检测器（Thermo Fisher Scientific 有限公司）；JP-040S 型超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；MS105DU 型十万分之一电子天平（Mettler Toledo 贸易有限公司）；BHS-2 型数显恒温双孔水浴锅（宁波市群安实验仪器）；HC-1016高速离心机（安徽中科中佳）；实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；SZ-150A-3型超速多功能粉碎机（永安善竹贸易有限公司）；C18 分析色谱柱（Waters 有限公司）；旋转蒸发仪N1100DWD（东京理化器械株式会社）。

1.2 药物与试剂表儿茶素对照品（含量以99.7%计，批号：110878-201703）、没食子酸（含量以91.5%计，批号：110831-201906）、儿茶素（含量以95.1%计，批号：110877-202005）、原儿茶酸（含量以97.7%计，批号：110809-201906）均由中国药品生物制品检定所提供；原花青素B2（含量以91.5%计，批号AF7060703）由成都埃法生物科技有限公司提供；金荞麦中药饮片（批号：C0842180072）由保和堂制药有限公司提供，经鉴定检测为蓼科植物金荞麦的干燥根；乙腈磷酸、乙醇、甲醇、甲酸、乙酸乙酯（分析纯）由国药集团化学试剂有限公司提供；乙腈、甲醇（色谱纯）由德国默克公司提供；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 混合对照溶液制备精密称定适量没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素置5 mL容量瓶中，加入甲醇定溶，配置成分别含0.26 mg/mL原花青素B2对照品溶液、0.232 mg/mL没食子酸对照品溶液、0.29 mg/mL儿茶素对照品溶液、0.35 mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.344 mg/mL原儿茶酸对照品溶液，精密量取原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素对照品溶液各1 mL，没食子酸对照品溶液0.4 mL，置10 mL容量瓶中并用甲醇定溶，配置成含34.4 μg/mL原儿茶酸对照品、29 μg/mL儿茶素对照品、9.28 μg/mL没食子酸对照品、35 μg/mL表儿茶素对照品、26 μg/mL原花青素B2对照品的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备取金荞麦提取物0.2 g，加入乙腈-水混合溶液适量，两者比例10∶90，用超声波清洗机超声溶解（功率250 W，频率33 kHz），转移至10 mL量瓶中，振荡摇匀，再用离心半径4 cm，15000 r/min 离心5 min，精密量取上清液，使用湿法上聚酰胺柱（30～60 目、18 cm 长、1.0 cm内径），先用50 mL水洗脱，再用100 mL的95%乙醇洗脱，丢弃水洗脱液，收集乙醇洗脱液，在60 ℃下浓缩至近干，用乙腈-水混合溶液多次溶解，收集至5 mL 容量瓶中，加乙腈-水混合溶液稀释定容至刻度线。

2.3 色谱条件与系统适用性条件Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm HPLC column）；流动相以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；进行梯度洗脱，流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。检测波长：278 nm；柱温：35 ℃。在此色谱条件下没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素能很好分离，理论塔板数应不低于9000，分离度＞1.5。见图1—2及表1。

表1 梯度洗脱程序

图1 混合对照品溶液

图2 金荞麦提取物供试品溶液

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取混合对照品溶液，分别以2、5、10、20、40、60 μL精密进样，按色谱条件测定没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素色谱峰面积，结果以进样量（μg）为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程见表2。

表2 各对照品回归方程、相关系数和线性范围（n=6）

2.4.2 稳定性试验 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h 进样，按色谱方法测定并计算原儿茶酸、没食子酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的RSD（n=5）分别为1.56%、1.62%、1.34%、1.28%、1.73%，表明供试品溶液在室温条件下8 h内稳定。

2.4.3 精密度试验 精密吸取混合标准溶液10 μL，连续进样5 次，测定峰面积。测得没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的RSD（n=5）分别为1.21%、1.40%、0.67%、0.92%、1.04%，表明仪器精密性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一方法提取制备的样品，按供试品溶液制备方法，平行制备6 份供试品溶液，依照色谱条件检测并计算其各成分含量，结果儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原儿茶酸、表儿茶素含量的RSD 分别为1.45%、1.94%、1.72%、2.04%、1.86%，表明实验方法具有良好重复性。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取1 份金荞麦浸膏0.2 g，依法按照“2.2”方法制成供试品溶液，并在其中加入定量混合标准品，连续进样5针，每针注入10 μL 于高效液相色谱仪，结果没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的平均回收率分别为93.54%、96.11%、98.17%、96.59%、100.1%，RSD分别为1.75%、2.01%、1.81%、2.57%、1.36%。

2.4.6 得膏率测定 取同一批次金荞麦中药饮片（批号：C0842180072）10 g，精密称定，按试验设计条件进行提取，提取液合并过滤，用旋转蒸发仪浓缩到一定量，再65 ℃干燥至恒重，冷却30 min，精密称定。得膏率（%）=干膏/药材×100%。

2.5 制备工艺优选

2.5.1 提取工艺选择 以乙醇为提取溶媒，溶剂量、溶剂浓度、回流时间是提取过程中比较重要的参考因素，为实现以最少的次数达到大量全面试验等效的结果，采用三因素三水平正交试验，见表3。

表3 提取因素和水平

2.5.2 提取工艺综合评分优选 按照L9（34）正交表安排试验，取9 份金荞麦药材，每份金荞麦根茎10 g，粉碎成粗粉，置于圆底烧瓶中，分别加入对应浓度及对应体积分数的乙醇，与药材混合进行回流提取，滤过，合并滤液，65 ℃浓缩成膏，干燥，即得样品，以没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素5 种成分含量（金荞麦药材成分含量）及得膏率为考察指标，进行综合评分，优选最佳提取工艺为指标筛选制备工艺。样品中成分含量=（测得样品成分的浓度×稀释体积/取膏量）×干膏量）/金荞麦药材质量。综合评分（%）=（没食子酸含量/组内最高值×15%+原儿茶酸含量/组内最高值×15%+儿茶素含量/组内最高值×15%+原花青素B2 含量/组内最高值×20%+表儿茶素含量/组内最高值×20%+干膏率/组内最高值×15%）×100%。见表4。

表4 正交试验设计及结果

2.5.3 方差分析结果 3 个因素中溶剂量和溶剂浓度具有显著差异，而回流时间显著水平微乎其微，可不做因素影响考虑，结合实际工艺生产时间、成本等因素选取回流时间为1.5 h，最佳溶剂量为10倍量，最佳溶剂浓度为55%的乙醇。见表5。

表5 方差分析

2.5.4 验证性试验 取3 份金荞麦粗粉，每份10 g，加入10 倍量55%的乙醇，回流1.5 h，回流2次，在60 ℃下浓缩并蒸发成金荞麦干膏。每份金荞麦干膏对应取0.2 g，用乙腈-水混合溶液溶解（10∶90），按照“2.1”方法制成供试品溶液，在相同色谱条件下测得表儿茶素、儿茶素、原花青素B2、没食子酸、原儿茶酸含量分别是190.178、51.013、323.214、79.542、141.63 μg/g，得膏率为21.54%，RSD 分别为1.27%、2.07%、1.95%、2.11%、1.65%，结果表明此工艺重现性好，稳定可行。

3 讨论

3.1 指标成分选择现代中药制剂提取工艺已将单一成分、单一因素为考察指标改为以多指标、多因素综合评分的方法来优选提取工艺，如王玲娇等［8］以多指标综合评分结合响应面法优选金卷升板胶囊提取工艺。何前松等［9］多指标评价苦参洗液提取工艺。

多指标综合评分是指根据不同成分在金荞麦中的含量、作用及在提取中影响因素分配不同占比系数［10］。原花青素B2、表儿茶素是金荞麦所含主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理作用［11］，在本研究综合评分中各占20%，为了尽可能筛选出最佳工艺，其他成分及得膏率也是重要因素，各占15%，这种设计能保证提取工艺的科学性和合理性，能提取出更多更有效的活性成分，保证金荞麦合剂的临床效果。

3.2 流动相选择首先按照药典标准用乙腈-水（10∶90）作为流动相［7］对对照品溶液及供试品溶液进行分离，结果表儿茶素在10 分钟时出峰，但供试品溶液在此时间的分离效果较差，其他成分难以分离。考虑到要检测没食子酸、原儿茶酸、儿茶酸，流动相以乙腈-0.1%磷酸水溶液，进行梯度洗脱，最后本试验梯度洗脱方法能很好分离供试品中各组分，这5种成分可以作为考察指标。

3.3 浓缩温度选择试验早期，每次过柱色谱后表儿茶素、儿茶素、没食子酸等含量不稳定甚至会消失，查询文献后发现儿茶素结构中含有活性酚羟基，这种物质结构在中性、碱性环境下容易发生改变，在高温情况下、潮湿和光照等环境条件下容易发生氧化聚合、异构化等反应，使其原有的生物活性发生改变［12］，在100 ℃条件下儿茶素主要发生脱没食子酸和异构化反应［13］，因此将温度设为60 ℃以保持主要成分含量的稳定。

3.4 试验优化方法选择试验优化的常用方法有正交设计、均匀设计、单纯行优化法、拉式优化法和效应面优化法等。本试验因素较多，因此选择正交试验设计法，正交设计是一种正交表安排多因素、多水平的试验，并用普通的统计表分析方法分析试验的结果，推断最佳水平的科学方法［14］。实现了以最少次数达到大量全面实验等效的结果，为实验节省了大量时间和器材。