流式细胞术检测儿童流感淋巴细胞亚群和NK细胞变化的研究

黄劼 袁雯 陶莹

流行性感冒简称流感，是临床上儿科、急诊常见的一种疾病，是流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，属于丙类传染病[1]。流感一般表现为急性起病，潜伏期通常为1 ～7 d，多为2 ～4 d，临床症状以高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状较重，而呼吸道症状（鼻塞、流鼻涕、咽喉痛、干咳等）较轻为主要特征[2-3]。流感严重者甚至出现呼吸衰竭、脓毒症休克、急性坏死性脑病、心力衰竭等情况，对患者心、肝、肾等多脏器功能造成严重的损伤，影响身体健康以及生命安全[4]。目前常见的流感主要有两种类型，即甲型流感和乙型流感，而人们感染的主要是甲型流感病毒中的甲1 亚型流感病毒（influenza virus of H1N1 sub type，H1N1）、甲3 亚型流感病毒（influenza virus of H3N2 sub type，H3N2）亚型以及乙型流感病毒中的维多利亚流感病毒（Victoria）和乙型山形流感病毒（Yamagata）系。所有5 岁以下的儿童都被公认为是重症流感的高危人群，但是2 岁以下的儿童患流感的风险最高，6 个月以下的婴儿因流感住院率和病死率最高[5]。孕妇、婴幼儿、老年人和慢性基础疾病等高危人群，患流感后出现严重疾病和病死的风险均较高。儿童感染流感后易出现高热、腹泻、呕吐、呼吸暂停等，对患儿的生长发育、免疫功能、生命安全造成严重的威胁。因此，明确儿童流感感染病毒的过程以及患儿机体免疫系统响应的过程，对于临床治疗儿童流感，降低并发症的发生，保障良好预后具有非常重要的价值和意义。基于此，本研究旨在探讨流式细胞术检测儿童流感成熟T 淋巴细胞（mature T lymphocytes，CD3+）、诱导性T 细胞/辅助性T 细胞（helper T cells，CD4+）、抑制性T 细胞/细胞毒性T 细胞（cytotoxic T cells，CD8+）、T 淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）表达水平的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022 年4 月—2023 年4 月于湘潭市第一人民医院儿科就诊的20 例流感患儿作为此次研究的观察组，再选取同时期于湘潭市第一人民医院进行体检的20 名健康儿童作为对照组。其中对照组男童10 名，女童10 名；年龄4 ～12 岁，平均（8.65±2.47）岁；身体质量指数20 ～25 kg/m2，平均（22.86±1.37）kg/m2。观察组男童11 例，女童9 例；年龄4 ～12 岁，平均（8.70±2.42）岁；身体质量指数20 ～25 kg/m2，平均（22.84±1.35）kg/m2；病程3 ～7 d，平均（5.45±1.12）d；流感类型：甲型流感12 例，乙型流感8 例。两组儿童性别、年龄、身体质量指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

纳入标准：（1）观察组儿童经临床诊断均符合《儿童流感诊断与治疗专家共识（2020 年版）》[6]中对儿童流感的诊断标准。（2）年龄4 ～12 岁。（3）所有儿童及监护人均知此次研究内容并签订知情同意书。（4）入院就诊前均未服用过任何药物。（5）个人资料齐全。排除标准：（1）普通感冒、其他上呼吸道感染、其他下呼吸道感染患儿。（2）精神烦躁、哭闹不止不配合研究者。（3）未获得儿童监护人知情同意。（4）免疫系统先天性异常或障碍者。（5）合并心、肝、肾等脏器恶性肿瘤或血液系统疾病者。

1.2 方法

研究开始前1 d 告知两组儿童及其监护人次日凌晨须空腹，检查开始前禁止进食和饮水。医护人员采集两组儿童清晨空腹外周血2 mL，置于乙二胺四乙酸二钾真空采血管中备用，随后使用BriCyte E6 流式细胞仪（迈瑞）分别检测两组儿童的CD3+、CD4+、CD8+、T 淋巴细胞亚群和NK 细胞表达水平，所有实验室检验操作均严格按照实验室、试剂盒、仪器要求进行操作，记录检测结果。其中儿童体内CD3+正常水平为61%～85%、CD4+正常水平为28%～58%、CD8+正常水平为19%～48%、T 淋巴细胞亚群正常表达水平为20%～40%，NK 细胞正常表达水平为7%～25%。

1.3 观察指标

比较两组儿童淋巴细胞亚群和NK 细胞表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

与对照组儿童相比，观察组患儿的CD3+、CD4+、NK细胞、T 淋巴细胞亚群表达水平均明显偏低（P＜0.05）；与对照组儿童相比，观察组患儿的CD8+表达水平均明显偏高（P＜0.05）。见表1。

表1 观察组与对照组儿童淋巴细胞亚群和NK 细胞表达水平比较（%，±s）

表1 观察组与对照组儿童淋巴细胞亚群和NK 细胞表达水平比较（%，±s）

组别 CD3+ CD4+ CD8+ NK 细胞 T 淋巴细胞对照组（n ＝20） 72.42±7.04 45.69±10.23 25.33±9.75 56.45±7.11 66.88±9.11观察组（n ＝20） 61.44±7.43 36.76±10.48 34.54±8.54 42.21±6.23 60.03±10.23 t 值 4.797 2.727 3.178 6.737 2.236 P 值 ＜0.001 0.010 0.003 ＜0.001 0.031

3 讨论

流感病毒容易发生变异，主要通过飞沫以及接触传染，传染性较强，人群普遍易感，发病率较高，历史上在全世界引起多次暴发性流行，是全球关注的重要公共卫生问题[7-8]。据世界卫生组织估计，每年季节性流感在全球可导致300 万～500 万重症病例，29 万～65 万病死。流感在中国以冬春季节多见，人们感染流感后临床表现以全身中毒症状为主，其次是呼吸道症状，而儿童发热程度通常高于成年人，患乙型流感时恶心、呕吐、腹泻等消化道症状较成年人多见[9-10]。目前，临床上普遍认为流感的发病机制复杂多样，认为主要是流感病毒进入人体呼吸道后，与呼吸道表面纤毛柱状上皮细胞的特殊受体结合而进入细胞中，然后在细胞内完成自我复制，新的病毒颗粒不断被释放并播散再感染更多其他的细胞，进而引起机体出现发热、头痛、肌痛等全身症状，甚至引起病毒性肺炎、脑病等[11-12]。此外，有诸多学者认为流感的发病还与环境因素（气候变量、经纬度等）、个体因素（基础慢性疾病、吸烟、劳累、压力大等）、易发生重症的高危人群（年龄＜5 岁或≥65 岁，肥胖、妊娠、围生期妇女等）等因素密切联系[13-14]。

儿童是流感暴发的高危人群，临床医护工作者以及监护人应该引起高度重视。儿童感染流感病毒后，病毒通过血凝素与呼吸道上皮细胞含有唾液酸受体的细胞表面进行结合，进而感染[15-16]。流感病毒侵袭机体后可以诱发细胞因子风暴，导致全身出现明显的炎症反应，出现急性呼吸窘迫综合征以及多脏器功能衰竭，对儿童身心的生长发育造成严重的影响[17-18]。目前，临床上普遍认为儿童感染流感病毒的发病机制主要是病原体直接侵害机体导致的，其次还认为其与儿童机体免疫功能紊乱有密切的关系[19]。目前，有部分研究指出，机体感染流感后淋巴细胞亚群和NK细胞水平会出现明显的变化，致使免疫功能出现紊乱，影响身体健康，危及生命安全[20]。

T 淋巴细胞简称T 细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中的胸腺素的诱导下，经过一系列有序的分化过程，逐渐在胸腺发育成熟为能够识别何种抗原的T 细胞库，通过淋巴以及血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能[21]。T 细胞是相当复杂的不均一体，又在体内不断地更新，在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群，但是其分类原则和命名尚未统一[22]。临床上根据免疫应答中的功能不同，将T 细胞分成若干亚群：CD4+、CD8+等。CD3+是指成熟的T 淋巴细胞，能够与T 细胞抗原受体（T cell antigen receptor，TCR）结合形成TCR-CD3+复合体分子，然后将抗原信号传递到细胞内。CD4+、CD8+能够分别于主要组织相容性抗原-Ⅱ（Major histocompatibility antigen-Ⅱ，MHC-Ⅱ）、主要组织相容性抗原-Ⅰ（Major histocompatibility antigen-Ⅰ，MHC-Ⅰ）分子结合，稳定TCR 与抗原肽-MHC 分子复合物的结合，促进体内激活信号的传递[23]。NK 细胞不同于T、B 细胞，它是一类不需要预先致敏就可以非特异性的杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞[24]。本研究结果发现，与对照组儿童相比，观察组患儿的CD3+、CD4+、NK 细胞、T 淋巴细胞亚群表达水平均明显偏低（P＜0.05）；与对照组儿童相比，观察组患儿的CD8+表达水平均明显偏高（P＜0.05）。说明经流式细胞术检测发现流感儿童均存在明显的体液以及细胞免疫功能紊乱。分析其原因可能与流感患儿感染流感病毒后，体内辅助性T 细胞受到侵袭和损伤，导致CD4+细胞、CD3+细胞分化过程受阻，无法正常分化，且损伤加重，致使T细胞的活性受到明显的抑制，增加CD8+的数量，最终导致免疫功能出现紊乱。此外，流感病毒侵袭机体免疫器官后，导致机体无法正常释放T 淋巴细胞，进而导致总的T 淋巴细胞数量明显降低，免疫功能损伤并受到抑制，机体出现炎症反应，又进一步影响免疫功能，加重流感病毒对机体的侵袭和损伤，形成恶性循环。当机体受到流感病毒的侵袭后，机体内免疫应答会发生相应反应，即NK 细胞被激活，然后与Fc 段进行结合，发挥非特异性的杀伤作用，直接杀死或破坏被流感病毒侵袭或感染的靶细胞。文章中体现了《儿童流感诊断与治疗专家共识（2020 年版）》[6]的临床参考。

综上所述，流感儿童均存在明显的体液以及细胞免疫功能紊乱，主要表现为CD3+、CD4+、NK 细胞、T 淋巴细胞亚群表达水平下降，CD8+表达水平上升，可为流感患儿的临床治疗、减少并发症及预后评估提供理论依据。