亲水作用色谱法测定达原饮中槟榔生物碱的含量

张 莹，刘 冰，郭 华，张博雄，何宇飞，刘云琪

（襄阳职业技术学院 医学院， 湖北 襄阳 441021）

达原饮又名“达原散”,首次出现在明代瘟疫学鼻祖吴又可所著的《温疫论》中,用于治疗瘟疫邪伏膜原证,［1］是治疗瘟疫的著名方剂。该方剂在我国抗疫历史中发挥了较好的治疗作用,被国家卫生健康委员会推荐为中医治疗处方,出现在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第三版及第八版中。［2～6］《温疫论》中记载达原饮药方为：“槟榔二钱、厚朴一钱、草果仁五分、知母一钱、芍药一钱、黄芩一钱、甘草五分。右用水二盅,煎八分,午后温服。”其中,“榔能消能磨,除伏邪,为疏利之药,又除岭南瘴气；厚朴破戾气所结；草果辛烈气雄；除伏邪蟠踞。三味协力,直达其巢穴。使邪气溃散,速离募原,是以名为达原散也。”［7］该药方中,槟榔为君药,厚朴、草果仁为臣药,知母、芍药和黄芩为佐药,甘草为使药。对达原饮药理研究发现,其中槟榔、厚朴、草果、黄芩和白芍具有抗氧化的作用,通过抗氧化应激反应抑制炎性因子产生,［8～10］达到治疗新型冠状病毒感染的作用。目前,临床上,达原饮主要以汤剂的形式应用。中药汤剂的制备是一个多环节的系统工程,中药饮片的产地、种植、采集、加工炮制、煎煮等因素均能影响汤剂的质量,汤剂质量对中医临床而言至关重要,直接影响临床治疗的效果。因此,确保中药汤剂的质量成为中医临床治疗的关键环节。

目前,对达原饮有效成分质量控制的研究较少,现有的研究也主要集中在臣药和佐药的有效成分厚朴酚、和厚朴酚、草果黄酮、芒果苷、芍药苷和黄芩苷上。［11～13］达原饮药方中的君药有效成分槟榔生物碱具有良好的抗氧化作用,［8］由于其极性较强,无法在普通C18色谱柱上保留而研究甚少。对于槟榔中槟榔生物碱的含量测定,《中国药典》（2020版）和一些文献报道［14～15］中采用强阳离子交换键合硅胶为填充剂（SCX-强阳离子交换树脂柱）。这一检测方法限制了达原饮中所有有效成分一次检出,增加了质量控制的成本和时间。本文采用亲水作用色谱法（HILIC）检测达原饮中槟榔生物碱的含量。该方法简单快速,稳定可靠,重复性好,为达原饮中有效成分的质量控制提供了有效的理论支撑和实验依据。

一、材料与方法

（一）材料

中药饮片：槟榔、厚朴、草果仁、知母、芍药、黄芩、甘草均购于中药房（襄阳普天独活大药房）；达原饮中的槟榔生物碱主要有四种：去甲槟榔碱、槟榔碱、去甲槟榔次碱和槟榔次碱,其中槟榔碱和去甲槟榔次碱对照品选择其氢溴酸盐和盐酸盐。对照品：去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱、去甲槟榔次碱盐酸盐和槟榔次碱,纯度均大于98%,购于成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯,水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）,其他试剂纯度均为分析纯。

液相色谱仪：Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、中药自动煎煮壶（九阳股份有限公司）、TGL-16M台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、BSA224S型分析天平（德国赛多利斯）。

（二）方法

1.供试品溶液的配制。查阅文献,明清时期的一钱相当于3.73 g,［16］水一盅相当于200 mL纯水。根据《温疫论》中的达原饮药方,确定达原饮汤剂的煎煮工艺为：称取槟榔7.46 g,厚朴3.73 g、草果仁1.87 g、知母3.73 g、芍药3.73 g、黄芩3.73 g和甘草1.87 g置于自动煎药壶中,量取300 mL纯水浸泡60 min,进行头煎。先用武火煮沸,后以文火煎煮30 min,将药汁倒出后进行二煎,加入纯水100 mL,先用武火煮沸,后以文火煎煮30 min,收集合并两次煎煮药液,用真空过滤器过滤、冷却,定容至200 mL,过0.22 µm滤膜作为供试品溶液。

2. 对照品溶液的配制。分别精密称取槟榔生物碱对照品：去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱、去甲槟榔次碱盐酸盐和槟榔次碱各5.00 mg,置于10 mL容量瓶中,用纯甲醇定容至刻度,摇匀,过0.22 µm滤膜作为槟榔生物碱各单独对照品溶液。再分别精密量取槟榔生物碱各单独对照品溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,用纯甲醇定容至刻度,摇匀,过0.22 µm滤膜作为槟榔生物碱混合对照品溶液。

3.色谱条件。色谱柱：Agela Venusil HILIC 丙基酰胺键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm,5µm,天津博纳艾杰尔科技有限公司）；流动相：乙腈：0.1%三乙胺（磷酸调节pH值至3.5）=70：30；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL•min-1。

二、结果与讨论

（一）专属性考察

槟榔生物碱混合对照品（a）及达原饮供试品色谱图（b）详见图1。由图可见,4种槟榔生物碱分别有与其对照品保留时间一致的特征色谱峰,各对照品之间完全基线分离,分离度良好,峰型对称,并且供试品中目标成分与杂质峰之间的分离度良好,峰型对称。结果表明,供试品中其它组分对槟榔生物碱的测定无干扰,本方法专属性良好。

图1 槟榔生物碱混合对照品（a）和达原饮供试品溶液（b）的HPLC图谱

（二）分析方法学考察

1. 线性关系考察。分别精密量取前述“对照品溶液的配制”制备的槟榔生物碱混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL置于六个10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成相应浓度的标准系列槟榔生物碱混合对照品溶液,按照前述“色谱条件”进样,以各槟榔生物碱的浓度为X,峰面积为Y,绘制标准曲线,得到各槟榔生物碱的回归方程和相关系数,详见表1。在浓度范围内,4种槟榔生物碱的线性关系良好,相关系数均在0.999 5以上。

表1 槟榔生物碱的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

2. 检出限与定量限考察。将前述“对照品溶液的配制”制备的槟榔生物碱混合对照品母液用纯甲醇逐级稀释,按照前述“色谱条件”进样检测,记录峰面积,根据上述绘制的标准曲线计算浓度。当信噪比（S/N）为3：1时,此条件下混合对照品的浓度为本方法的检出限；当信噪比（S/N）为10：1时,此条件下混合对照品的浓度为本方法的定量限。4种槟榔生物碱的检出限和定量限见表1。

3.精密度考察。取槟榔生物碱混合对照品溶液,按照前述“色谱条件”连续进样6次,记录每次各生物碱的峰面积,对其相对标准偏差（RSD）值进行计算,经过计算得到去甲槟榔碱RSD值为1.52%,槟榔碱RSD值为1.62%,去甲槟榔次碱RSD值为1.59%,槟榔次碱RSD值为1.53%。结果表明,仪器精密度良好。

4. 重复性考察。取同一批中药饮片,按照前述“供试品溶液的配制”分别制备6批供试品溶液,按照前述“色谱条件”分别进样检测,记录各槟榔生物碱的峰面积和保留时间,分别计算峰面积和保留时间的相对标准偏差（RSD）值,去甲槟榔碱、槟榔碱、去甲槟榔次碱和槟榔次碱的峰面积及保留时间的RSD 值分别为1.01%/0.78%、0.99%/0.89%、0.98%/0.98%和1.03%/0.76%。结果表明,本方法重复性良好。

5.稳定性考察。取前述“供试品溶液的配制”制备的供试品一份,在室温分别下放置0,4,8,12,16,20,24 h,按照前述“色谱条件”分别进样检测,记录色谱图,计算各槟榔生物碱的峰面积及保留时间的相对标准偏差（RSD）值,通过计算去甲槟榔碱、槟榔碱、去甲槟榔次碱和槟榔次碱的峰面积及保留时间的RSD 值分别为1.12%/0.89%、1.21%/0.87%、1.15%/0.86%和1.04%/0.98%。结果表明,该方法稳定性良好。

6. 加标回收率试验。精密量取前述“供试品溶液的配制”制备的达原饮药液供试品5 mL,共36份。每9份为一组,每组按照槟榔生物碱含量的80%、100%、120%分别加入低、中、高3个水平的各槟榔生物碱单独对照品,每个水平3份平行样品。按照前述“色谱条件”分别进样分析,记录色谱图,各槟榔生物碱的加标回收率结果详见表2。去甲槟榔碱、槟榔碱、去甲槟榔次碱和槟榔次碱的平均回收率分别为102.05%（RSD=1.39%）、100.80%（RSD=1.39%）、102.87%（RSD=1.39%）和98.77%（RSD=1.39%）,结果表明本方法加标回收率良好。

表2 达原饮中4种槟榔生物碱的加标回收率（n=9）

7. 样品含量测定。取前述“供试品溶液的配制”制备的达原饮药液,按照前述“色谱条件”进样检测,记录色谱图,根据前述“线性关系考察”所做标准曲线计算达原饮中各槟榔生物碱的含量。通过检测计算,达原饮药液中去甲槟榔碱含量为0.0209 mg•mL-1,槟榔碱含量为0.0679 mg•mL-1,去甲槟榔次碱含量为0.0545 mg•mL-1,槟榔次碱含量为0.0269 mg•mL-1。

三、结论

经典抗疫名方达原饮由槟榔、厚朴、草果、知母、白芍、黄芩和甘草7味药材组成,其中槟榔为君药,其主要活性为槟榔生物碱。由于槟榔生物碱为小分子生物碱,极性较大,在传统C18色谱柱上无法保留,因而多采用强阳离子交换柱SCX进行检测。这就限制了达原饮中所有活性成分同时检出,增加了达原饮药液质量控制的成本。本文首次建立了亲水作用色谱法测定达原饮中槟榔生物碱含量。结果表明,其专属性较好,在24.63～300.60µg•mL-1浓度范围内线性关系良好,稳定性和重复性良好,准确度较高。该方法为达原饮药液的质量控制提供了实验依据,并为达原饮中有效成分的一次性测定提供了新思路。