环状RNA 在喉癌细胞调控中的研究进展

赵壮壮，夏立军

山西医科大学第一临床医学院/山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，太原 0300000

喉癌是上呼吸道第二常见的恶性肿瘤，约占所有头颈癌的30%[1]，其中约90%为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）[2]。目前，喉癌的治疗手段主要以手术治疗为主，以放疗、化疗和免疫治疗为辅。部分喉癌患者早期无明显症状，确诊时已处于疾病中晚期[3]。一项荟萃分析显示，喉癌患者的5 年总生存率为64.2%[4]。近年来，随着高通量测序技术的出现，发现环状RNA（circular RNA，circRNA）失调普遍存在于多种恶性肿瘤中，参与肿瘤的发生和发展[5]。喉癌中也存在多种失调circRNA，并通过不同的调控机制影响疾病进展。本文对国内外相关文献进行综述，总结喉癌相关circRNA 的分子机制和临床意义。

1 circRNA 概述

circRNA 被发现已有40 余年[6]。起初，circRNA 被认为是细胞异常剪接产生的无生物学功能的副产品[7]。随着高通量测序技术的应用，越来越多种类的circRNA 被发现[8]。circRNA 是一类具有组织特异性表达模式和发育特异性表达模式的单链共价闭环RNA，源自前体信使RNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA）或长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）反向剪接[5]。circRNA 的生物学功能主要包括[9]：①充当微小RNA（microRNA，miRNA）海绵，与miRNA 直接结合后抑制其活性；②位于细胞核的某些内含子来源的circRNA 可以调控其亲本基因的转录过程；③作为蛋白质支架或者拮抗剂与RNA 结合蛋白相互作用，参与转录、翻译和蛋白降解；④部分circRNA 参与蛋白质翻译。失调的circRNA 在肿瘤的各个方面发挥促癌或抑癌作用，包括肿瘤的发生、增殖、侵袭、迁移、凋亡和化疗耐药等[10-11]。

2 circRNA 发挥促癌作用

circSHKBP1 通过调节miRNA-766-5p/高迁移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）轴促进LSCC 的增殖、侵袭。Chen 等[12]通过定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测60 例LSCC 组织及邻近正常组织中circSHKBP1 的表达，结果表明，circSHKBP1 在LSCC 组织中高表达，随后根据circSHKBP1 的中位表达水平将60 例患者分为高表达组和低表达组，发现circSHKBP1 高表达患者的总生存率较低。同时，circSHKBP1的高表达与LSCC患者的高TNM分期及淋巴结转移显著相关。miRNA-766-5p是一种肿瘤抑制因子，可抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡[13-14]。HMGA2 是HMGA 蛋白家族的成员，在多种肿瘤中高表达，可通过多种途径影响肿瘤的恶性生物学行为。有研究报道，喉癌细胞中HMGA2 显著增加，并且促进喉癌中的上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[15]。进一步研究circSHKBP1 在喉癌中的作用机制发现，circSHKBP1 作为miRNA-766-5p 的海绵，抑制miRNA-766-5p 的活性，而HMGA2 则是miRNA-766-5p 的作用靶点。上调的circ-SHKBP1 通过靶向miRNA-766-5p 调节HMGA2 过表达，促进LSCC 细胞的增殖和侵袭，从而发挥致癌作用。

circRNA_103862 通过靶向miRNA-493-5p/高尔基体 膜蛋白1（golgi membrane protein 1，GOLM1）轴促进LSCC 细胞的增殖。Wang 等[16]通过原位杂交技术和qRT-PCR 检测技术，分别检测了152 例LSCC 石蜡切片和62 例LSCC 组织及邻近非肿瘤组织中circRNA_103862 的表达量，发现circRNA_103862 在LSCC 组织中显著上调，此外，circRNA_103862 的高表达与LSCC 患者的高临床分期、淋巴结转移相关，与总生存时间呈负相关。研究发现，miRNA-493-5p 在乳腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤等多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用[17-19]。GOLM1 也称为高尔基体蛋白73（golgi protein 73，Gp73）或高尔基体磷酸蛋白2（golgi phosphoprotein 2，Golph2），是一种Ⅱ型跨膜蛋白，在质膜转运、信号转导方面发挥重要作用，同时在多种肿瘤中发挥促癌或抑癌作用[20-21]。Zhao 等[18]发现，在肝细胞癌中，miRNA-493-5p 可以直接靶向GOLM1，抑制肝癌细胞增殖，并诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。相关机制研究表明，circRNA_103862 过表达通过海绵化miRNA-493-5p 上调GOLM1 的表达，促进LSCC 细胞的增殖和侵袭。

circBFAR 通过miRNA-31-5p/Ⅴ型胶原α1 链（collagen type Ⅴalpha 1 chain，COL5A1）轴促进LSCC 的增殖、迁移、侵袭和血管生成。Zhu 等[22]通过泛癌分析发现，COL5A1 在多种恶性肿瘤中高表达，并且与患者的预后不良相关。miRNA-31-5p 在不同种类的恶性肿瘤中发挥不同的作用，Mi 等[23]发现miRNA-31-5p 在结直肠腺癌中高表达，并且发挥促癌作用。相反，Gong 等[24]的研究发现，miRNA-31-5p 在LSCC 组织和细胞中发挥抑制肿瘤细胞侵袭、迁移和血管生成的作用。COL5A1是miRNA-31-5p 的靶基因之一，并受到miRNA-31-5p 的负调控。circBFAR 通过海绵化miRNA-31-5p 降低其表达量，导致COL5A1 表达量升高，促进喉癌细胞的侵袭和迁移。

circMTCL1 通过补体C1q 结合蛋白（complement C1q binding protein，C1QBP）依赖的方式激活WNT/β-联蛋白（β-catenin）信号转导，促进LSCC 细胞增殖、侵袭和迁移。C1QBP主要位于线粒体基质中，与线粒体氧化磷酸化功能相关。此外，C1QBP在多种肿瘤细胞中增加，通过与肿瘤细胞微环境中的补体以及激肽系统的分子相互作用，在肿瘤细胞生长、转移和侵袭中发挥关键作用[25]。WNT/β-catenin信号通路在多种肿瘤中发挥作用，WNT/β-catenin信号的异常激活与发病率增加、恶性进展、预后不良，甚至肿瘤相关死亡率的上升密切相关[26-27]。Wang 等[28]发现，circMTCL1 在LSCC 组织和细胞中的表达显著上调，并且与分化程度、T 分期、淋巴结转移和临床分期显著相关。进一步的机制研究发现，circMTCL1 通过特定的结合序列与C1QBP 相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径抑制其降解来提高C1QBP 的表达，激活WNT/β-catenin 信号通路，促进LSCC 细胞增殖、侵袭和迁移。

3 circRNA 发挥抑癌作用

Wang 等[29]对5 对喉癌组织及邻近正常组织进行高通量转录组测序，发现circ-RANBP9 在喉癌中表达较低。进一步检测47 对喉癌组织及癌旁组织中circ-RANBP9 的表达水平，观察到circ-RANBP9在大多数喉癌组织中低表达，构建受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，曲线下面积为0.716，灵敏度和特异度分别为0.979 和0.553，提示circ-RANBP9 在喉癌中具有一定的诊断效能。通过对47 例喉癌患者预后及临床特征与circ-RANBP9 表达相关性的研究发现，circ-RANBP9 低表达与较低的生存率、较差的分化程度、淋巴结转移和较高的临床分期显著相关。细胞实验结果表明，circ-RANBP9 过表达可以抑制喉癌细胞的迁移、侵袭和EMT，提示circ-RANBP9 在喉癌中发挥抑癌作用。目前circ-RANBP9 在喉癌中的抑癌机制尚不明确，推测可能通过与hsa-miRNA-5787 相互作用，在喉癌中发挥抑癌作用。

Guo 等[30]利用qRT-PCR 法检测了41 对LSCC组织和邻近正常组织中hsa_circ_0036722 的表达水平，检测结果表明，hsa_cir_0036722 在LSCC 组织中的表达水平显著低于邻近正常组织。ROC 曲线分析表明，hsa_cir_0036722 可以作为诊断LSCC 的生物标志物，曲线下面积为0.838。Rh 家族C 糖蛋白（Rh family C glycoprotein，RHCG）被证实在LSCC 中发挥抑癌作用[31]。进一步的功能实验表明，hsa_cir_0036722 通过海绵化miRNA-1248，上调RHCG 的表达，从而抑制LSCC 细胞的增殖。

4 circRNA 与喉癌化疗耐药

4.1 circPARD3

Gao 等[32]同样利用qRT-PCR 技术检测了100 对LSCC 组织及邻近正常黏膜组织中circPARD3 的表达水平，发现LSCC 组织中circPARD3 表达水平显著高于邻近正常黏膜组织，此外，circPARD3 高水平与T 分期、颈部淋巴结转移和临床分期显著相关。根据circPARD3 表达水平的中位数将100 例LSCC患者分为高表达组和低表达组，Kaplan-Meier生存分析显示，circPARD3 高表达患者的总生存期明显缩短。在此前的研究中发现，miRNA-145-5p作为肿瘤抑制剂抑制LSCC 细胞的增殖、迁移和侵袭[33]。Gao 等[32]通过微阵列分析得出蛋白激酶Cι（protein kinase C iota，PRKCI）是miRNA-145-5p 的直接靶基因，细胞实验表明PRKCI在LSCC 中发挥促癌基因的作用，促进细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药。此外，作为蛋白激酶C 家族的一员，PRKCI 可以直接磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）从而激活AKT 信号通路，激活的AKT 通路可以进一步磷酸化雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR），从而抑制细胞自噬[34]。circPARD3作为miRNA-145-5p的海绵，可上调PRKCI 的表达，进一步激活AKT-MTOR 信号轴，促进LSCC 细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗耐药。

4.2 circ_0004507

Yi 等[35]发现，相比正常组织，喉癌组织中circ_0004507 的表达增加，相比Ⅰ期和中高分化喉癌患者，Ⅲ期和低分化喉癌患者肿瘤组织中的circ_0004507 表达量明显升高，同时circ_0004507 表达上调与淋巴结转移阳性率呈正相关。随后根据对顺铂化疗的敏感性将30 例喉癌患者分为化疗敏感组和化疗耐药组，结果发现，化疗耐药组患者的喉癌组织中circ_0004507 表达高于化疗敏感组。进一步机制研究发现，circ_0004507 主要存在于细胞质中，并且是miRNA-873 的海绵。miRNA-873 被证明在食管癌中通过抑制分化胚胎软骨细胞表达基 因2（differentiated embryonic chondrocyte expressed gene 2，DEC2）发挥抑癌作用[36]。而在卵巢癌中，Wu 等[37]发 现miRNA-873 过表 达 可以 通过靶向P-糖蛋白来增加卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性。因此，在喉癌组织中circ_0004507 过表达降低了miRNA-873 的表达量，从而降低了其对顺铂化疗的敏感性。但是，目前对于circ_0004507/miRNA-873 的下游靶点仍然未知，需要在今后的研究中进一步探索。

4.3 circ_0005033

研究发现，miRNA-107 在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。Yan等[38]发现miRNA-107可以通过靶向TP53 调控的细胞凋亡抑制剂1（TP53 regulated inhibitor of apoptosis 1，TRIAP1）在体内和体外抑制胃癌细胞增殖。Liu等[39]研究发现，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，循环外泌体miRNA-107 可以通过靶向14-3-3η抑制肿瘤发生。胰岛素样生长因子1 受体（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）是酪氨酸激酶的一种，被发现在多种恶性肿瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌等）中表达均升高[40]。Li等[41]发现IGF1R在骨肉瘤中促进肿瘤细胞的化疗耐药。Gong等[42]发现circ_0005033在喉癌组织中的表达较正常组织明显升高，此外，circ_0005033 在喉癌中是miRNA-107 的海绵，IGF1R 是miRNA-107 的靶点。circ_0005033 高表达使miRNA-107 表达下调，从而促进IGF1R 表达量增加，促进喉癌细胞的增殖、侵袭、迁移和顺铂耐药。

目前，circRNA 与喉癌的研究逐渐增多，现将近年来的研究结果进行汇总，详见表1。

表1 circRNA 与喉癌的相关研究

5 小结与展望

目前，寻找新的喉癌诊断生物标志物和新的治疗靶点，仍是一项富有挑战性的工作。许多circRNA 的宿主基因在肿瘤中发挥致癌或抑癌作用。circRNA 来源于这些基因的同时，反过来也可以调节其宿主基因的转录、翻译、亲本蛋白的活性，从而参与肿瘤的发生发展。目前，关于circRNA 与恶性肿瘤相关性的研究正在如火如荼地进行着，相信随着科学技术的进步，circRNA 在喉癌中的作用机制将逐步被揭示，届时，circRNA 有可能成为喉癌中有效的诊断及预后生物标志物，甚至成为喉癌治疗的新靶点。