前列宁通过调控前列腺MMP-2、TIMP-2降解层粘连蛋白治疗良性前列腺增生的机制研究

周建衡，赵锦燕，王雪皎，李 斐，林久茂*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）不可避免发病于中老年男性，尿路梗阻是其较为常见症状，而且随年龄增加发病率逐渐增加［1］。调查显示，该病发病率规律是每增加十岁BPH 发病率就增加10%，男性从40 岁开始，BPH 患病率随着年龄而逐渐升高，80 岁时患病率将达到80%以上［2］。BPH 的病因及病理生理机制迄今仍不完全清楚，目前认为间质-上皮的相互作用与BPH 发病相关性已得到医学界普遍认可［3-4］，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在间质-上皮相互作用中发挥至关重要作用，层粘连蛋白（laminin，LN）是ECM 重要成分之一，与BPH 有密切联系［5-7］。前期研究表明，前列宁（Qianliening，QLN）对BPH 具有明显治疗作用［8］。本研究旨在通过体内外实验观察QLN 对前列腺组织、BPH-1 细胞中LN 及LN 调控因子表达的影响，探讨QLN 对BPH 的治疗机制。

1 材 料

1.1 实验动物及细胞 雄性SPF 级6～7 周龄健康雄性SD 大鼠50 只，体质量（150±20 g），购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，批号：0017446，实验动物许可证号：SCXK（沪2017-0005）。大鼠饲养于福建中医药大学实验动物中心，饲养室温度为20～26 ℃，相对湿度40%～70%，灯照周期为12 h，7：00～19：00 灯照，19：00～7：00 黑暗。本实验获福建中医药大学动物伦理委员会批准（审批号：FJTCM IACUC 2022178）。人前列腺增生细胞-1（humanbeing prostatic hyperplasia cell-1，BPH-1）由深圳Otwo Biotech公司提供，批号：HTX2051。

1.2 实验药物与主要试剂 QLN 由酒大黄15 g，水蛭3 g，黄芪12 g，牛膝9 g，菟丝子6 g 组成，该方由福建中医药大学药学院研制并已申请发明专利；丙酸睾丸酮注射液（上海通用药业股份有限公司，规格：25 mg/mL，批号：H31020524）；细胞培养双抗100×（上海汉恒生物科技有限公司，批号：HB-PSS-100）；细胞裂解液（批号：MB9900-Apr-12H）、细胞增殖及毒性试剂盒（批号：C0042）均购自大连美仑生物技术有限公司；鼠MMP2-抗体（批号：66366-1-lg）、兔LN（批号：12858-1-AP）均购自美国Proteintech公司；兔TIMP-2 抗体（美国Immunoway 公司，批号：YT4659）。

1.3 主要仪器 ChemiDoc XRS 凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；Countstar 细胞自动计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；PowerPAC™ HC 高电流电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；RM2235 石蜡切片机（德国徕卡公司）；常规倒置显微镜（德国徕卡公司）。

2 方 法

2.1 QLN 药液制备 动物灌胃用QLN 由福建中医大学药学院制备；细胞用QLN 购自江苏天江药业颗粒剂，以200 mg QLN 粉末，加入1 mL 蒸馏水溶解后高压、超声助溶，配制成浓度为200 mg/mL 的母液，用完全培养基DMEM 倍比稀释后配置成3 种不同浓度（0.25、0.5、1.0 mg/mL）的工作液，0.22 μm 过滤器过滤后加入细胞中。

2.2 BPH 大鼠模型制备 依据前期基础及查阅文献成功制备模型［9-10］，SPF 级雄性SD 大鼠50 只，6～7 周龄，适应性喂养1 周，除空白组外，其余各组腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，无菌手术，摘除双侧睾丸，术后恢复1 周，模型组及低、中、高剂量组皮下注射丙酸睾酮（5 mg/kg），连续28 d。

2.3 分组及干预 采用数字随机法将大鼠分为空白组、模型组和低、中、高剂量组，每组10只。模型组及低、中、高剂量组去势1 周后注射造模同时，开始灌胃给药，空白对照组和模型组灌服生理盐水，各剂量组采用灌胃QLN。剂量分别为：空白组、模型组生理盐水10 mL/（kg·d），低剂量组3 g/（kg·d）、中剂量组6 g/（kg·d）、高剂量组12 g/（kg·d）；即分别相当于临床用药量的3、6、12 倍，以上均采用灌胃给药，1 次/d，期间每周称体质量1 次并按体质量调整给药剂量，共28 d。

2.4 标本采集 末次给药后禁食12 h，大鼠体质量，手术分离出完整的前列腺组织，测量前列腺湿重和体积（容积法）；选取相同部位前列腺组织一块，10%甲醛固定作免疫组化用。

2.5 指标检测

2.5.1 大鼠前列腺湿重、体积和前列腺指数 测量5 组大鼠的前列腺的湿重、体积并计算前列腺指数（PI），PI 的计算公式如下：

PI＝前列腺湿重（g）/体质量（g）

2.5.2 免疫组化法测5 组大鼠前列腺组织LN 的蛋白表达水平 分别取5 组大鼠前列腺组织侧叶0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 组织块，PBS 清洗，10%甲醛进行固定，包埋存档，切片。石蜡切片分作LN 免疫组化染色，一抗（比例1∶1 000），二抗（比例1∶1 000），PBS 洗，标记后PBS 洗，DAB 显色，严格按说明书操作。

2.5.3 QLN 干预BPH-1 细胞培养及形态学观察用0.25%胰酶消化并收集细胞，之后每孔加入3 mL含低（0.25 mg/mL）、中（0.5 mg/mL）、高（1.0 mg/mL）不同浓度QLN 药液的完全培养基及等量完全培养基，分别在干预24、48 h 后，倒置显微镜下观察细胞的形态、数量变化并拍照。

2.5.4 CCK-8 法检测BPH-1 细胞存活率 用0.25%胰酶消化并收集细胞，分别在12、24 h 时避光加入10 μL CCK-8 溶液，1.5～2 h 后在酶标仪（570 nm 波长下、持续震荡15 s）检测其吸光值。细胞存活率的计算公式如下：

细胞存活率＝用药组A值/空白组（对照组）A值×100%）

2.5.5 Western blot 检测BPH-1 细胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表达量 用0.25%胰酶消化收集离心后，总蛋白浓度测定与定量，电泳，转膜，封闭，于化学发光成像系统ChemiDoc XRS+下成像。用Image J软件对蛋白灰度值进行数据分析，得出MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法 所得数据采用Prism GraphPad 8.0.1 作图，并采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。数据均采用正态检验及方差齐性检验，计量资料服从正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 5组大鼠前列腺湿重、体积和PI比较 见表1。

表1 5 组大鼠前列腺湿重、体积和PI 比较（±s）

表1 5 组大鼠前列腺湿重、体积和PI 比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组PI 0.13±0.01 0.26±0.021）0.22±0.032）0.21±0.022）0.22±0.012）n 10 10 10 10 10前列腺湿重/g 0.54±0.06 0.87±0.121）0.76±0.082）0.71±0.072）0.71±0.112）体积/mL 0.53±0.03 0.85±0.111）0.72±0.092）0.60±0.082）0.60±0.062）

3.2 5组大鼠前列腺组织中LN蛋白表达量比较 见图1。

图1 5 组大鼠前列腺组织中LN 蛋白表达（×400）及阳性表达率比较

3.3 4组BPH-1 细胞形态及经QLN 干预后活力变化 倒置显微镜下观察，空白组BPH-1 细胞形态正常，呈菱形，细胞边界菱角清晰，细胞贴壁牢固，细胞汇合度紧密；经QLN 干预后，随着QLN 浓度的增加，可观察到细胞形态完整性逐渐改变，细胞呈悬浮状态，细胞汇合度降低，出现细胞脱落，悬浮细胞逐渐增加。见图2。CCK-8 检测显示，与空白组比较，低、中、高剂量组细胞活力在24 h 及48 h 均显著下降（P＜0.05），且QLN 药物浓度越高而细胞活力越低，其中以中、高剂量组最为显著，但QLN 干预24 h 与干预48 h 比较差异无统计学意义（P＞0.05），不存在时间依赖关系。见图3。

图2 4 组BPH-1 细胞形态比较（×100）

图3 4 组BPH-1 细胞24、48 h 细胞活力变化（5 000 个细胞/孔）

3.4 4组BPH-1 细胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表达量比较 见图4。

图4 4 组BPH-1 细胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表达量比较

4 讨 论

BPH 在中医学中归属为“癃闭”“精癃”等范畴，其病因病机迄今仍未诠释。现代医学研究显示，ECM 学说一直是BPH 发病的重要机制［11］，ECM主要成分包括胶原蛋白、LN、纤维连接蛋白（FN）等，其中，collagens、elastin、LN 等与BPH 密切相关［12］。有研究显示，前列腺细胞的增殖与ECM 增加密切相关，ECM 与各种生长因子及雄-雌激素相互作用发生BPH，前列腺组织中活性肽类物质也可以由ECM 调节，刺激细胞产生不同的ECM［13-17］。ECM 受多种酶类降解，其中MMPS是最重要的一类，MMP-2属于MMPS 家族中的明胶酶，可降解collagenⅣ、FN和LN 等，MMP-2 在降解上述ECM 过程中受到其抑制剂TIMP-2 调控，MMP-2、TIMP-2 达到一定比值时，能发挥最佳调控效果［18-19］。

BPH 的基本病机为热毒瘀阻、气血失调、痹阻络脉、日久肾虚而致。针对此病机，课题组提出了祛瘀软坚、补肾益气的治法，研制成前列宁方。课题组研究发现，QLN 对BPH-1 细胞增殖有抑制作用，可诱导细胞凋亡，并对多种细胞因子有调节作用，对BPH 治疗具有明显效果［20-23］，同时可以调节部分ECM 成分及MMP-2 作用［10］。在体内实验中，动物模型组大鼠前列腺指数、前列腺体积明显高于空白组，各剂量组中大鼠前列腺指数、前列腺体积较模型组不同程度减少，表明QLN 具有治疗大鼠BPH 作用；免疫组化检测大鼠前列腺组织LN 蛋白表达水平明显减少，表明LN 蛋白减少与治疗BPH具有相关性，与文献报道一致［17-19］。体外实验中，QLN 直接购自江苏天江药业成分颗粒剂，未采取含药血清给药而是蒸馏水溶解后高压、超声助溶方法，在前期研究中已取得成熟稳定给药方法，结果稳定可靠［23，10］。在细胞实验中，经QLN 干预的低、中、高剂量组中细胞存活率呈现不同程度下降，CCK-8 检测显示QLN 作用24 h 和48 h 后各组细胞存活率出现不同程度下降，与空白组比较，QLN 药物浓度越高细胞存活率越低，其中以0.5、1 mg/mL最为显著；Western blot 检测发现，QLN 干预细胞培养，MMP-2、LN 蛋白表达量明显降低，TIMP-2 蛋白表达量升高，表明在细胞培养中QLN 能够有效抑制MMP-2、LN 蛋白表达量并且具有增强TIMP-2 蛋白表达量作用，与体内实验中QLN 降低BPH 大鼠模型前列腺组织LN 表达水平一致，同时体外实验中QLN 降低MMP-2 蛋白表达量，提高TIMP-2 蛋白表达量升高，与文献报道ECM 调控与MMP-2、TIMP-2密切相关，并非单纯受MMP-2影响。

综上所述，本研究证实了QLN 调控前列腺组织细胞MMP-2、TIMP-2 降解LN 从而对BPH 起 到治疗作用，具有一定临床指导意义，后期将围绕QLN 可能通过调控微小基因片段降解ECM 治疗BPH 展开进一步研究，以期深入阐明QLN 治疗BPH 机制。