不同测定方法下叶片穿透力与叶片功能性状之间的关系

欧美景 李红燕 赵秋菊 李佳蔚*

（1.广西大学林学院，广西森林生态与保育重点实验室，南宁 530004； 2.广西大学林学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004）

叶片是植物光合作用的主要器官，负责重要的碳同化过程［1］，而暴露在自然环境中的叶片会经历生物因素（虫食）和非生物因素（风雨、干旱）等导致的机械物理损伤，这在一定程度上会影响叶片的光合作用。叶片力学性状为叶片抵抗外界机械损害的能力，叶片穿透力和叶片撕裂力是人们通常测定的叶片力学性状，可以表征叶片的机械抗性［2］。理论上，叶片机械抗性较高的植物往往有较高的叶片穿透力和撕裂力［3］，叶片穿透力模拟的是昆虫在取食叶片时咬破叶片的力，而叶片的撕裂力模拟的是植食动物和风损害叶片时撕裂的力［4-5］。叶片机械力测定可有效反映叶片抗物理损伤的情况，是衡量叶片碳投资的关键指标［6］。

目前，叶片功能性状与叶片机械抗性之间的关系一直是人们关注的热点问题，对其的探讨有助于了解植物在全球化天气变化背景下的生存适应策略，很多的研究表明叶片密度［7-9］、角质层［10］、干物质含量［11］和比叶面积［12］、叶片厚度［13］等叶片结构性状是影响叶片机械抗性的内在因素，而生长环境的变化是影响叶片机械抗性的外在因素［14］。同时，叶片机械抗性的强弱和叶片构建成本具有紧密的联系。叶片的构建成本是叶片形成以及发挥其功能所需的能量投资成本，不同生活型的植物因叶片性状结构的差异而采取不同的叶片构建策略，同时影响着资源获取的竞争能力；因此，不同生活型植物在平衡叶片构建成本和收益间表现出不同的能量策略［15-17］，使得其机械抗性的强弱和叶片寿命也不相同［7，12，14，18-21］。

叶片机械力的测量方法主要分为3大类，如穿透力测试、撕裂力测试、剪切测试，研究表明，3 种测量方法均可以用作测量区域或全球范围内叶片机械阻力的一般指标，而后两者在机械抗性的测量中较为常用［7，13］。穿透力和撕裂力是测试叶片断裂所需的最大力，一般情况下，有两种最常用的叶片断裂标准化参数的方法。一种是以单位断裂周长标准化的穿透力（Fp）和撕裂力（Ft），其反映了叶片单位断裂长度抵抗外力的程度，通常被称为“结构阻力”；另外一种是以单位截面面积标准化的特定穿透力（Fps）和特定撕裂力（Fts），其被称为“材料阻力”；“结构阻力”和“材料阻力”在专业术语上被称为“机械阻力”［7］。

叶片机械阻力在测量的过程中往往会受到一些因素的影响。穿透力测试是用推拉力计的针头将平放在模具中的叶片（避开叶脉）穿破的过程，此过程的影响因素有机器速度、针头和冲模之间的间隙、针头的边缘定义和针头的面积［22］；穿透力测试过程快速且易于执行，只要合理的设计影响因素就能在测试时更准确地反映出叶片的机械阻力。然而，在穿透力测试过程中叶片断裂时的物理性质存在不确定性，针头面积与测试结果之间的关系尚未有详细研究，但有研究发现针头面积是影响测试结果的重要因素；另外，也有研究者发现穿透力测试可以提供与叶片生物学物理方面的相关性，可检测叶片断裂特性的生态显著变化［22-23］。

在叶片穿透力测试的过程中，研究者所用的穿刺针直径有所差异。Maenpuen等［24］用直径0.6 mm和1.0 mm 的穿刺针测定叶片穿透力与LMA 之间的关系；Read & Sanson［20］采用0.5 mm 直径穿刺针测量不同物种和不同叶型的各种穿透力学性质；He等［25］用1.2 mm直径穿刺针对107种植物的叶片穿透力进行测定；Arellano-Rivas 等［26］采用1 mm 直径穿刺针测量了23 种优势植物的叶片穿透力；Lusk 等［27］测量了13 种不同耐阴性的热带雨林常绿植物的阳叶和阴叶的LMA（单位面积叶片重量）和细胞壁含量，并采用2 mm 圆柱形直径穿刺针进行穿透力测试，以了解叶片结构和生物力学对遮阴的适应性和可塑性反应。虽然以往的研究探讨了叶片机械阻力的力学测试方法，但不同穿刺针直径尺寸、校准方法等因素影响穿透力结果以及该影响结果与叶片性状的关系数据尚未有明确的报道。本研究以30 种双子叶植物为研究对象，通过测定其叶片穿透力、叶片撕裂力、叶片功能性状等指标，比较30 种植物在不同直径穿刺针下的穿透力差异，分析穿刺针直径和校准方法对叶片穿透力测定的影响，探讨3种生活型植物在不同直径穿刺针作用下叶片机械力测定差异是否影响其与叶片功能性状的关系，以期为叶片机械抗性测定筛选合适的穿刺针直径尺寸以及校准方法提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

试验材料采自广西大学，其位于南宁市（22°13′—23°32′N，107°45′—108°51′E），属亚热带季风性气候，年均气温21.7 ℃，雨热同季，年均降雨量1 304.2 mm，春秋两季不分明，冬季低温干燥［28］。园占地面积307 hm2，海拔约80 m，园内植物定期养护，生长状况良好，种类丰富，园内有蕨类植物7 科10 种，裸子植物7 科13 种，被子植物105科479种。

1.2 试验材料

基于前期对广西大学校园内物种的调查，从双子叶3 个不同生活型植物中分别随机采取10 个物种，从《中国植物志》确定广西大学30 种代表性植物的科、生活型等信息（表1）。

表1 30种植物的分类和生活型信息Table 1 Taxonomy and life-form information of the 30 studied species

每个物种选取3～6 株长势良好的植株，木本植物则选取向阳的一端分别采集5～10 片健康成熟的叶片，草本植物则剪取带叶枝条，分别放入带有湿纸巾的自封袋中，避光保存带回实验室，每个物种从不同的植株个体共选取6张叶片，用于叶片机械力学以及叶片形态解剖结构的测定。叶片性状缩写及单位见表2。

表2 叶片性状缩写及单位Table 2 Leaf trait abbreviations and units

1.3 试验方法

1.3.1 叶片机械抗性

叶片穿透力为穿透单位周长的叶片所需的最大力，特定叶片穿透力为穿透横截面积的叶片所需的最大力。用小型拉力测验机（ZQ 990，中国）分别记录2.0、1.0、0.5 mm 的平端直径针（dpr）穿透叶片（避开主脉和次级脉）所需的最大力［29］，即：叶片穿透力=最大穿透力/针的周长；特定叶片穿透力=叶片穿透力/叶片厚度。

叶片撕裂力为撕裂单位宽度的叶片所需的最大力［30］。切取中脉两侧5 mm×25 mm的长条［31］，用小型拉力测验机测定撕裂单位宽度（d=5 mm）的叶片长条所需的最大力［29，32］，即：叶片撕裂力=最大撕裂力/切取的叶片宽度。

1.3.2 叶片比叶面积

比叶面积为每单位干质量的叶片面积［33］。擦干叶片水分和杂质后剪掉叶子的叶柄，用Li-Cor叶面积仪（Li-3000A，美国）测定叶片面积［34］，对于较大叶片则沿主脉将其切成两半后依次测量；后将叶片样品放入信封，置于烘箱70 ℃烘干，48 h后取出，用分析天平称量叶片干质量；叶片干质量与叶面积的比值为叶片比叶面积，即：比叶面积=叶面积/叶干质量。

1.3.3 叶片厚度和角质层厚度

根据Onoda等［10］对叶片结构的测定方法，研究首先于叶片主脉两侧中部切取一块5 mm×15 mm的长条，将其平行放入5 mm×30 mm长方形小块的胡萝卜切口中，固定叶片；用双面不锈钢刀片做叶片横切的徒手切片，制成临时装片，在光学显微镜（Leica DM3000，德国）下观察，在5 倍物镜视野下拍取图片用于测量叶片厚度，40 倍物镜下拍取图片用于测量上下角质层厚度，拍照后用Image J 软件测量。

1.3.4 叶脉密度

在叶片主脉两侧中部剪取面积约1 cm×1 cm的叶片组织（不同叶片视大小情况而定），先浸泡在福尔马林溶液试管中脱色备用，后放入盛有体积比为1∶1 的冰乙酸和30%过氧化氢混合溶液的试管中［35］，于水浴锅中70 ℃加热，待叶片褪色至透明后撕开叶片表皮，用0.5%番红染液染色，后用50%乙醇洗去浮色，在光学显微镜5倍物镜下观测叶脉，拍照后用Image J 软件计算叶脉长度；叶脉密度为单位叶片面积上的叶脉总长度。

1.4 数据统计与分析

所有数据在Excel 2010记录统计的基础上，采用SPSS 23.0 软件的单因素方差分析（ANOVA）和双因素方差分析（two-way ANOVA）比较3种生活型植物在3种不同直径作用下穿透力的差异，用皮尔逊相关性分析比较叶片穿透力学与撕裂力及叶片性状之间的关系，并用R 统计软件中的dplyr和smatr软件包对2种校准方式下的穿透力与叶片结构性状在不同穿刺针直径间进一步做斜率异质性相关性分析；采用Image J软件中的macros函数计算每个物种的叶脉总长度；采用Sigmaplot和R统计软件中的ggplot2软件包作图。显著性水平均为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同测定方法对叶片穿透力测定的影响

2.1.1 不同校准方法及穿刺针直径对叶片穿透力测定的影响

由图1可见，在以周长和横截面积两种不同的校准方法下，30 个研究物种的叶片穿透力（图1A）和特定叶片穿透力（图1B）在3 种不同直径穿刺针之间具有不同程度的差异（P＜0.05）。在以周长校准的穿透力中，约有76% 的物种在0.5 mm 和1.0 mm，及0.5 mm 和2.0 mm 直径穿刺针之间的Fp均具有显著差异（P＜0.05），有33%的物种在1.0 mm和2.0 mm 直径穿刺针之间的Fp 差异显著（P＜0.05）。其中狗肝菜（Dicliptera chinensis）在穿刺针直径为1～2 mm 的Fp 差异最小，为0.000 7 kN·m-1；人心果（Manilkara zapota）在2.0 mm 和0.5 mm 的Fp 差异最大，为0.270 0 kN·m-1。在以横截面积校准的穿透力中约有66%的物种在0.5 和1 mm 直径穿刺针之间的Fps差异显著（P＜0.05），有56%的物种在0.5 mm 和2.0 mm 直径穿刺针之间的Fps差异显著（P＜0.05），有30%的物种在1 和2 mm 直径穿刺针之间的Fps 差异显著（P＜0.05）。其中狗肝菜在穿刺针直径为 1 和2 mm 之间的Fps 差异最小，为0.002 4 MN·m-2；人心果在2.0 mm 和0.5 mm 之间的Fps差异最大，为1.299 0 MN·m-2。总体而言，90%的物种在0.5 mm 直径穿刺针作用下的Fp、Fps均显著大于1和2 mm。

图1 3种穿刺针直径处理下以周长校准的穿透力（A）和以横截面积校准的穿透力（B）的差异不同小写字母代表同种植物在3种直径针间的穿透力在P＜0.05水平上的差异显著性；数值为平均值±标准差；下同Fig.1 Differences in force-to-punch calibrated by circumference（A） and force-to-punch calibrated by cross-sectional area（B） under three puncture needle diameter treatments Different lowercase letters represent the significance of differences in force-to-punch of the same plant among the three diameters of needles at the P＜0.05 level；Date presented as mean±standard deviation；The same as below

2.1.2 不同测定方法的叶片穿透力在3种生活型植物之间的差异性

通过双因素方差分析（表3）发现，3 种生活型之间的Fp、Fps 存在极显著差异（P＜0.01），而3 种直径针之间的Fps 存在显著差异（P＜0.05）。同一生活型的植物在2 种不同的校准方式下，3 种不同直径针之间的Fp（图2A）和Fps（图2B）的差异均不显著，且Fp 和Fps 大小都为直径针0.5 mm 大于1 mm 和2 mm。而在灌木和乔木生活型中，比较两者在3 种不同直径针之间的Fp 和Fps 均无显著差异，但两者与草本在3 种不同直径针之间的Fp 和Fps 均有显著差异（P＜0.05），且Fp 的由大到小依次为灌木、乔木、草本，而Fps 由大到小则是乔木、灌木、草本。

图2 3种生活型植物在不同穿刺针直径处理下以周长校准的穿透力（A）和以横截面积校准的穿透力（B）的差异不同小写字母表示在同一穿刺针直径处理下3种生活型植物的叶片穿透力和特定叶片穿透力在P＜0.05水平上的差异显著性Fig.2 Differences in force-to-punch calibrated by perimeter（A） and force-to-punch calibrated by cross-sectional area（B） among the three life form plant species under different treatments of puncture needle diameter Different lowercase letters indicated the significance of differences in force-to-punch and specific force-to-punch at the P＜0.05 level for the three lifeform of plants treated with the same puncture needle diameter

表3 不同校准方法下3种生活型植物在不同穿刺针直径间叶片穿透力测定的差异Table 3 The difference of leaf force-to-punch among three Life form plants with different puncture needle diameters under different calibration methods

2.2 不同校准方法下3种穿刺针直径的穿透力与叶片功能性状之间的关系

由图3 可见，在不同的校准方法及3 种穿刺针直径的测定下，3种生活型植物的Fp和Fps分别与叶片功能性状的相关性具有一定的差异；总体来看，草本与叶片性状之间的显著相关性数量较少，乔木与叶片性状间的显著相关性数量较多，且Fp与叶片性状的相关性比Fps 与叶片性状的相关性更强。

图3 3种生活型植物在3种穿刺针直径下以周长校准的穿透力（A）和以横截面积校准的穿透力（B）与叶片功能性状的相关性Fig.3 Correlation of force-to-punch（A） calibrated by perimeter and force-to-punch（B） calibrated by cross-sectional area with leaf functional traits in three life form at three puncture needle diameters

由图4 可见，30 种双子叶植物在以周长校准方法下，3 种直径穿刺针的Fp 与上角质层厚度、下角质层厚度、叶片撕裂力、叶片厚度有极显著的正相关关系（P＜0.01），同时与比叶面积呈极显著负相关关系（P＜0.01）、与叶脉密度无显著相关性，其中穿刺针直径2 mm 的Fp（R=0.923，P＜0.001）、穿刺针直径0.5 mm 的Fp（R=0.915，P＜0.001）与叶片撕裂力的相关性大小近似相等（图4：A1～6）。在以横截面积的校准方法下，3 种直径针的Fps 与叶片撕裂力有极显著的正相关关系（P＜0.01），与叶脉密度和叶片厚度无显著相关性；穿刺针直径2 mm 的Fps 与上角质层厚度呈极显著的正相关关系（P＜0.01），与比叶面积呈极显著的负相关关系（P＜0.01）；穿刺针直径1 mm 的Fps 和穿刺针直径0.5 mm的Fps则分别与上、下角质层厚度有显著的正相关关系（P＜0.05），与比叶面积呈显著负相关关系（图4：B1～6）。此外，叶片功能性状中的上、下角质层厚度、叶片厚度等指标与叶片撕裂力呈显著的正相关（P＜0.05），同时比叶面积也与叶片撕裂力呈显著负相关关系（图5）。总体来看，Fp与叶片性状的相关性比Fps 与叶片性状的相关性更强；同时，通过斜率异质性检验的分析发现，3 种穿刺针直径之间的Fp、Fps 分别与叶片性状间的关系无显著差异（见表4），说明3 种穿刺针直径测定的穿透力差异不会影响穿透机械力与叶片功能性状的相关关系。

图4 30种植物在3种穿刺针直径下以周长校准的穿透力（A）和以横截面积校准的穿透力（B）与叶片功能性状的相关性R为相关系数；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；下同Fig.4 Correlation of force-to-punch calibrated by perimeter（A） and force-to-punch calibrated by cross-sectional area（B） with leaf functional traits in 30 plants at three puncture needle diameters R was the correlation coefficient；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；The same as below

图5 叶片撕裂力与叶片功能性状的相关性A.叶片厚度；B.比叶面积；C.角质层厚度（黑色填充点和实线为上角质层厚度，白色填充点和虚线为下角质层厚度）；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001Fig.5 Correlation between leaf force-to-tear and leaf functional traits A.Leaf thickness；B.Specific leaf area；C.Cuticle thickness（black filling points and solid lines are upper cuticle thickness，white filling points and dotted lines are lower cuticle thickness）；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

表4 两种校准方式下的穿透力与叶片功能性状在不同针直径间相关性斜率异质性分析Table 4 Comparison of the correlation slope between two measures of force-to-punch and leaf functional traits using different needle diameter

3 讨论

3.1 穿刺针直径及校准方法对叶片机械力学的影响

穿刺针直径会影响叶片穿透力的测定结果。Aranwela 等［22］在评估叶片断裂特性的方法研究中得出叶片的穿透力会随着穿刺针直径的增大而增大，而本研究发现30 个物种的叶片穿透力测定结果会随着穿刺针直径的大小而变化，但有90%物种在0.5 mm直径穿刺针作用下的叶片穿透力显著大于1 mm和2 mm。这两者结果的差异，一方面可能来自于叶片组织的差异，另一方面可能是大小范围不同的穿刺针直径在测定同一个物种的叶片穿透力时也具有差异。通常而言，叶片组织具有不均匀性，且穿刺针头作为圆剪，在测试的过程中叶片会受到针头的剪切和压缩破坏的混合力［36］，使得针端的周边发生不受控制的断裂，且此断裂并不都是圆形的［22］。在小范围内，直径小的针头会接触到相当均匀的叶片组织，而随着针直径的增大，接触到的不均匀组织增多而更容易断裂，这可能就会使得直径大的针头其机械抗性的力比直径小的针头小。因此在测量叶片穿透力学的试验中选用固定直径的穿刺针，对减少实验误差以及数据的标准化具有重要的作用。

穿刺针直径会影响叶片穿透力的结果，而校准方法也会对叶片穿透力的测定结果有影响。本研究中同一物种在以周长校准方法下3 种穿刺针直径之间的穿透力差异显著性数量多于以横截面积校准的方法；在不同生活型中，以周长校准下，灌木的叶片穿透力大于乔木和草本，这与以横截面积校准下叶片穿透力随着草本、灌木、乔木生活型的变化而逐渐增大不同。同一物种在两种校准方法下3 种穿刺针直径之间的穿透力差异显著性存在较大差异，这可能与叶片本身的性状有关。叶面积较小且叶片厚度较厚的植物在测试的过程中很难避开次生脉，会导致叶片穿透力结果比正常值偏大；且与以周长校准不同的是，横截面积的校准会将叶片厚度标准化［7，22］，这可能就使得叶面积小且叶片厚度不均匀的植物在以周长校准方法下的差异性要大于以横截面积校准方法下的差异性。而同一生活型植物在不同校准方法下3 种穿刺针直径的穿透力均无显著差异；说明在这两种校准方式下3 种穿刺针的直径大小对叶片穿透力无显著影响。

3.2 不同测定方法下叶片穿透力的差异与叶片功能性状之间的关系

比叶面积反映植物获取和利用资源的能力，是衡量叶片机械抗性强弱的关键性状。一般情况下，快速生长的物种往往具有较高的比叶面积值、较高的光合速率和营养水平，但植物寿命短，机械抗性弱；而生长缓慢的物种则与此相反［4，37］。本研究中两种校准方法下3 种穿刺针直径间的叶片穿透力与比叶面积呈显著负相关，说明植物在低比叶面积值下有较高机械抗性，这可能是比叶面积值越低，叶肉细胞壁和叶片角质层所占的叶片体积比例越大，植物对于构建叶片保卫结构或叶肉组织投入越多，从而能够更好地抵御病虫害［15，38-39］。

叶片厚度和角质层是反映叶片机械强度的重要性状指标，尤其能够反映叶片抗虫食能力的强弱，叶片和角质层越厚则机械抗性越强［40］。张贻礼等［41］研究表明，茶树叶片越厚，叶质越硬，虫口密度越小，其抗病虫害能力越强；也有研究表明，角质层越厚，植物抵御病虫害的能力越强，且上表皮角质层厚度大于2 μm 时，是一个强的抗虫性指标［42-44］。叶片角质层富含有高能量的角质和蜡质，是叶片屏障的主要支撑，叶片和角质层的厚度越厚，叶片的构建成本往往越高，机械抗性越强［45］。本研究发现，以周长校准下3种穿刺针直径间的叶片穿透力与角质层厚度和叶片厚度均有显著的正相关关系，而在横截面积校准下3种穿刺针直径间的叶片穿透力与角质层厚度呈显著正相关，但与叶片厚度无显著相关性，这可能是在横截面积校准下将叶片厚度标准化的结果。本研究中以周长校准的穿透力与叶片性状相关性显著高于以横截面积校准的穿透力与叶片性状的相关性，这也进一步证实了以穿刺针直径周长与断裂特性的相关性比以横截面积与断裂特性的相关性要好［22］，此外，本研究中两种校准方法下3种穿刺针直径间的叶片穿透力与叶片撕裂力呈显著正相关，说明其都是叶片机械阻力和结构稳健性的良好指标。

叶脉含有厚壁组织和纤维细胞，具有较高的机械阻力和弹性，对叶片的机械支撑和防御等具有重要作用。Hua 等［46］发现叶脉密度与叶片撕裂力和叶片穿透力呈正相关关系，且认为叶脉的机械特性是影响叶片机械阻力、结构和叶片经济谱的潜在因素。本研究中发现叶片机械抗性与叶脉密度呈无显著正相关，这与Kawai等［21］在叶脉性状如何协调叶片力学特性和水分利用性状的研究中发现，小叶脉密度与机械特性和叶片结构性状无显著正相关的结果一致，其表示叶片脉络层次各司其职，主脉和次级脉影响着叶片的结构和力学特性，而小脉则影响着叶片水分的运输和气体交换。

总的来说，物种在两种校准方法下3种穿刺针直径间的叶片穿透力分别与叶片性状的相关性存在差异，该差异与叶脉密度、角质层厚度、比叶面积、叶片厚度等叶片的结构性状有关。而本研究中发现在3 种穿刺针直径下的穿透力对其叶片性状的相关性具有差异，但经过比较，此差异无显著影响，且2 mm、0.5 mm 穿刺针直径的穿透力与叶片性状的相关性R值相对较高；此外，不同校准方法下的叶片穿透力与叶片性状的相关性强弱具有差异，且此差异可能会影响研究者在分析数据时的准确性。因此在研究中统一穿刺针直径和校准方法将有利于减小数据误差，同时提高数据准确性。

4 结论

物种在不同校准方法下3 种穿刺针直径间叶片穿透力测定结果存在差异，不同校准方法下3种穿刺针直径之间的叶片穿透力在同一生活型中差异不显著，而在草本分别与灌木和乔木两种不同生活型中差异显著，同时0.5 mm 直径针的穿透力均大于1 mm和2 mm。

叶片角质层厚度、叶片厚度、比叶面积等叶片性状指标以及叶片撕裂力可以很好地预测叶片的机械抗性；不同校准方法测定的穿透力差异会影响穿透机械力与叶片功能性状相关关系的强弱；而3 种穿刺针直径测定的穿透力差异不会影响穿透机械力与叶片功能性状的相关关系。

本研究从叶片穿透力测量的影响因素出发，揭示了不同穿刺针直径和校准方法下叶片穿透力之间的差异，以及该差异对其与叶片功能性状相关性的影响。叶片穿透力测试过程中校准方法和穿刺针直径的选择对数据的标准化和准确性至关重要，在此建议在两种校准方法下首先选用以针周长校准的方法，在3种穿刺针直径中选用0.5 mm测量叶面积小、叶脉密度大且较薄的叶片，选用2 mm 测量叶面积大、叶脉密度大且较硬的叶片。如今，随着气候变化的加剧，植物在不同的环境中会有不同的机械抗性以及叶片的结构性状，在此研究基础上，未来可选用合适的针直径和校准方法测量地域植物的机械抗性强度，探讨其与叶片性状的关系，研究植物在不同环境中的群落动态变化及生态演替。