逆境胁迫下山新杨PdbHMGs基因表达模式分析

王春瑶 雷晓锦 刘中原

（林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040）

1973 年，在牛胸腺细胞中第一次发现了1 种在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中泳动速度很快的蛋白——高迁移率族蛋白（high mobility group，HMG）［1］。HMG 蛋白根据其DNA 结构特点分成3 组：HMGA、HMGB 和HMGN［2］。其中，HMGB 存在数量最多，平均每10～15 个核小体中含有1 个HMGB 分子［3］，HMGA 主要分布在早期胚胎组织中，HMGN广泛分布于细胞核［4］。

HMGB 是一类存在于真核生物中且包含1 个由70～80 个氨基酸组成的高度保守结构域（HMGbox）的功能蛋白。通常HMGB 可以通过修饰或改变染色质或DNA 的结构，使不同种类的蛋白质分子形成大分子复合物来调控基因转录，从而在动、植物中参与多种生物途径发挥不同生物学功能［5］。

已有报道发现，在动物中存在与肿瘤细胞的增殖和转移相关的HMGB基因。当小鼠HMGB1基因被敲除后，会导致其生命力急速衰退，在出生后不久就死亡，说明HMGB 蛋白在维持小鼠的生命活动中发挥重要作用［6］。与此同时，发现HMGB与肝癌的形成和发展有关，当小鼠HMGB1的表达量降低时，会抑制肝癌细胞的增殖能力［7］。

植物中，HMGB 蛋白已陆续在拟南芥（Arabidopsis thaliana）［8］、水稻（Oryza sativa）［9］、玉米（Zea mays）［10］、裂叶牵牛（Ipomoea nil）［10］、黄瓜（Cucumis sativus）［10］和豌豆（Pisum sativum）［11］等中被鉴定与分离，随着研究的不断深入，发现HMGB 是植物生命活动中必不可少的一类功能蛋白。如拟南芥AtHMGB15 可通过与花粉转录因子AGL66 和AGL104 发生作用，进而调控花粉管的生长发育［12］。在牵牛花中，PnHMG1基因的表达与光周期的变化息息相关，主要在牵牛花的开花过程中发挥作用［10］。此外，HMGB基因在植物抵御逆境胁迫的过程中同样扮演着关键的角色。如在拟南芥中，当受到干旱和盐胁迫时，AtHMGB2和AtHMGB3的 表 达 量 显 著下 调［13］。AtHMGB1和AtHMGB2的过表达都能使高盐环境下的种子萌发及生长受阻；在冷处理下，AtHMGB2、AtHMGB3和AtHMGB4的表达量显著上调［14］。在高温和干旱等非生物胁迫下，水稻OsHMGB3基因的表达被显著诱导，OsHMGB3的过表达极大地提高了水稻对渗透胁迫的抵抗能力［9］。在木本植物中仅对白桦（Betula platyphylla）进行了研究，如过表达BpHMG6能显著增强白桦对高盐环境的耐受性［15］。

林木具有保持水土、减轻温室效应和净化空气等生态功能，在保持陆地生态平衡中起着关键的作用。杨树是我国减少土地荒漠化，退耕还林的优良树种之一［16］，而山新杨（Populus davidiana×P.bolleana）作为山杨（P.davidiana）与新疆杨（P.albavar.pyramidalis）的杂交后代，凭借生长迅速，适应能力强，抗逆性好，防风固沙等性状，成为了我国优良的速生造林树种［17-18］。本研究从山新杨中通过对其序列特征的分析鉴定了 7 条PdbHMGs基因，并对这7个基因逆境胁迫后的表达模式进行了分析，为研究该家族在非生物胁迫下的功能奠定基础。同时，为杨树抗逆基因工程育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理方法

选取长势一致、状态优良的山新杨组培苗，待其生长至5 cm 左右时移栽到V（泥炭土）∶V（蛭石）=3∶1 的混合基质中，花盆规格为11 cm×10 cm，环境条件为光照14 h/黑暗10 h，平均温度为（23±1）℃、相对湿度为60%～70%、光照强度为400 μmol·m-2·s-1的温室中培养。待株高约为10 cm 时进行胁迫处理。分别用200 mmol·L-1NaCl、20%PEG6000、150 μmol·L-1CdCl2和100 μmol·L-1ABA 进行根部浇灌处理，每个托盘中浇2 L处理液，每2天处理1次。以清水浇灌的山新杨苗为对照，每个处理重复3次。在处理3、6、9、12、24、48 h后，分别取地上部分叶和地下部分根，经液氮速冻后，保存在-80 ℃用于后续试验。

1.2 山新杨PdbHMGs基因生物信息学分析

在山新杨基因组中通过拟南芥同源比对找到7条PdbHMGs基因的氨基酸序列；利用在线软件GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）分析PdbHMGs基因的内含子-外显子结构［19］；利用Protparam（http：//web/expasy/org/protparam/）分析获得山新杨PdbHMGs基因编码蛋白的相对分子质量和理论等电点等［20］。使用Expasy-Protscale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/）预测PdbHMG 蛋白的亲水性［21］。通过在线 软 件CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）对PdbHMG蛋白进行亚细胞定位预测［22］。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在线软件分析了PdbHMG蛋白的保守基序，并通过TBtools进行可视化处理［23］。通过拟南芥信息资源数据库TAIR网站（http：//www.arabidopsis.org/）［24］查找出17条拟南芥AtHMGs蛋白序列，白桦中报道有11条BpHMGs 蛋白［15］，BpHMGs 蛋白序列下载自Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/，Betula platyphylla v1.1），通过MEGA 6.0将这17个AtHMGs蛋白序列和11个BpHMGs蛋白与山新杨PdbHMGs蛋白序列进行系统进化分析，使用邻接法Neighbor-Joining（NJ）构建进化树，Bootstrap参数设置为1 000［25］。利用NCBI 的Conserve Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测PdbHMG蛋白的保守结构域［25］，并运用BioEdit 软件将山新杨PdbHMGs蛋白进行多序列比对分析。

1.3 山新杨PdbHMGs基因启动子区顺式作用元件分析

在山新杨基因组中查找获得PdbHMG家族基因起始密码子上游约2 000 bp 的序列作为启动子区。利用Plantcare 网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行顺式作用元件预测分析［26］。

1.4 实时荧光定量RT-PCR

使用CTAB 法提取不同胁迫处理下山新杨叶和根的总RNA。取1 μg 总RNA 进行反转录，反转录反应体系和操作参照李亚博［27］的方法。将所有反转录产物cDNA 用作实时荧光定量RT-PCR 反应模板。选择内参基因Pdbactin（基因登录号：ON357379）作为对照，定量引物序列如下（表1）。使用伯乐公司生产的OpticonMonitor 2 荧光定量PCR 仪进行qRT-PCR 实验，qRT-PCR 的反应体系及程序同李亚博［27］。为确保实验结果的重现性，qRT-PCR 进行3次重复。利用2-△△Ct方法［28］对基因的相对表达量进行分析，图中所有基因的表达水平都进行了log2转化。

表1 实时荧光定量RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of real-time quantitative RT-PCR

2 结果与分析

2.1 山新杨PdbHMGs基因的获得

通过拟南芥同源查找得到7 条山新杨PdbHMGs基因（命名为PdbHMG1～7），进一步序列比对发现这7 个基因具有完整的开放读码框（ORF）。开放读码框长度为456～2 004 bp，编码的氨基酸数量在151～667。预测蛋白相对分子质量为16.72～75.54 kDa，理论等电点（pI）为5.35～9.36。亚细胞定位的预测结果显示7 个PdbHMGs 蛋白除PbdHMG6 预测定位于细胞质，其余6 个蛋白均定位在细胞核（表2）。分析PdbHMGs基因的外显子-内含子结构，发现7 个PdbHMGs基因都包含多个内含子。其中，PdbHMG6包含的内含子数最多（18 个），其余几个PdbHMGs基因包含的内含子数在5～7 个（图1）。对PdbHMG 蛋白的亲疏水性进行了预测分析，由图2 可知，所有PdbHMG 蛋白均为亲水性蛋白。

图1 山新杨PdbHMGs家族基因内含子-外显子结构Fig.1 Exon-intron structure of PdbHMGs genes

图2 山新杨PdbHMG蛋白亲水性Fig.2 Hydrophilic analysis of PdbHMG proteins

表2 山新杨7个PdbHMGs基因序列特征Table 2 Sequence characteristics of 7 PdbHMGs in Populus davidiana×P. bolleana

2.2 PdbHMG 蛋白多序列比对和系统进化树分析

拟南芥AtHMGs 分为HMGA 和HMGB 2 个亚家族，所有山新杨PbdHMGs基因均与拟南芥的HMGB亲缘关系更近，均聚在HMGB亚家族（图3）。保守结构域分析和多序列比对结果显示，所有PbdHMG 蛋白均含有1 个HMG-box 保守结构域（图4），其中PdbHMG1和PdbHMG2相似度更高（图5）。

图3 山新杨PdbHMGs与拟南芥AtHMGs、白桦BpHMGs成员的系统进化关系Fig.3 Phylogenetic relationship among PdbHMGs，AtHMGs with BpHMGs

图4 山新杨PdbHMGs蛋白保守结构域Fig.4 Conserved domain of PdbHMGs protein

图5 PdbHMGs蛋白HMG-box结构域Fig.5 HMG-box domain of PdbHMGs protein

利用在线网站MEME［23］对山新杨PdbHMG 家族蛋白的保守基序进行分析。结果显示，7个PdbHMG 蛋白的HMG-box 保守结构域均包含Motif1 和Motif2。此外，PdbHMG3、PdbHMG4 和PdbHMG5除包含Motif1 和Motif2 外，还包含Motif 3、4、6、8，且Motif 位置分布相似，推测PdbHMG家族基因编码的蛋白在具有保守性的同时，也会在功能上存在多样性（图6）。

图6 PdbHMG家族蛋白保守基序分析Motif 1～10用不同的颜色表示，Motif 1～10序列展示在下方Fig.6 The protein conserved motif analysis of PdbHMG family Motif 1-10 indicated by different colors.The sequences of the motifs 1-10 were shown below

2.3 山新杨PdbHMGs基因启动子特征分析

通过Plantcare数据库，分析了PdbHMGs基因启动子区的顺式作用元件［26］。结果发现，在PdbHMGs的启动子区包含了大量的响应植物激素和非生物胁迫的元件。包括与脱落酸、生长素、水杨酸、茉莉酸甲酯、赤霉素和乙烯相关的激素响应元件；以及与非生物胁迫响应相关的胁迫响应元件、损伤反应元件、厌氧诱导元件和MYB干旱诱导性结合位点（表3）。上述结果表明，PdbHMGs可能在植物生长发育及对逆境胁迫的应答过程中发挥关键作用。

表3 PdbHMGs基因启动子区顺式作用元件Table 3 Analysis of cis acting elements in promoter region of PdbHMGs

2.4 山新杨PdbHMGs基因应答逆境胁迫表达模式分析

为了解PdbHMG1～7基因是否能对非生物胁迫做出应答，分别用NaCl、PEG6000、CdCl2和ABA 处理山新杨，利用qRT-PCR 分析根和叶中7 个PdbHMGs基因的表达模式。

2.4.1 NaCl 处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式分析

在根中，PdbHMG3、PdbHMG5的表达在所有时间点均显著上调，其他基因在大部分时间点表现为下调表达趋势，但PdbHMG2在12 h 时表达明显上调（210.47倍）。PdbHMG7在12 h时表达也被明显诱导，为对照的29.87 倍，其他时间点表达量显著下调。PdbHMG1和PdbHMG6在4 个胁迫时间点表达显著下调，在其他时间点表达显著上调或无显著变化。PdbHMG4在除3 h 外的其他胁迫时间点表达显著下调或无显著变化（＜2倍）（图7a）。

图7 NaCl胁迫处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式a.根；b.叶；图中所有基因的表达水平都进行了log2转化Fig.7 Expression analysis of PdbHMGs under NaCl stress.a.Roots；b.Leaves；All relative transcription levels of genes were log2 transformed

在叶中，大部分的PdbHMGs基因，包括PdbHMG1、PdbHMG2、PdbHMG3和PdbHMG6的表达在所有胁迫时间点上均有不同程度的上调或无显著变化。而PdbHMG4和PdbHMG7的表达则表现在全部时间点显著下调或无明显变化。PdbHMG5的表达在9 h 时显著上调，为对照的26.02 倍，在其他时间点呈下调表达或无显著变化（图7b）。

2.4.2 PEG6000处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式分析

在 根 中，PdbHMG1、PdbHMG3、PdbHMG4、PdbHMG5在大部分胁迫时间点显著上调，但PdbHMG4在48 h 表达显著下调，仅为对照的2.06%，PdbHMG1和PdbHMG2在胁迫12 h 时被明显下调，分别为对照的17.29%和1.47%，PdbHMG3在胁迫9 h 时被明显下调，为对照的8.55%。而PdbHMG6和PdbHMG7则在全部时间点表达量显著降低或无明显变化（图8a）。

图8 PEG6000胁迫处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式a.根；b.叶Fig.8 Expression analysis of PdbHMGs under PEG6000.a.Roots；b.Leaves

在叶中，PdbHMG2的表达，除48 h表达量变化不明显外，其他胁迫时间点均显著上调，最高表达水平出现在胁迫初期（6 h），达到对照的33.63 倍。PdbHMG4、PdbHMG6在6 h 时显著下调（分别为对照的46.22%、20.31%），在9 h 时被显著诱导（分别为对照的9.98 倍、3.52 倍），其他时间的表达量无明显变化。而其他基因在大部分时间点表现为下调表达趋势，但PdbHMG5在9 h 时被显著诱导，为对照的3.42倍（图8b）。

2.4.3 CdCl2处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式分析

在根中，PdbHMG1和PdbHMG7的表达在大部分的胁迫时间点显著下调或无显著变化（除PdbHMG1在24 h 显 著 上 调，PdbHMG7在12 h 显 著 上调）。其他基因主要表现为上调表达趋势。特别的是，PdbHMG3、PdbHMG5在胁迫9 h 表达显著下调，分别为对照的21.14%、29.80%。PdbHMG2在胁迫中期表达显著上调，其他时间点表达量变化小。PdbHMG6大部分胁迫时间点显著上调或无显著变化且在胁迫初期（3～6 h）就被明显诱导（图9a）。

图9 CdCl2胁迫处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式a.根；b.叶Fig.9 Expression analysis of PdbHMGs under CdCl2.a.Roots；b.Leaves

有趣的是，在叶中，除PdbHMG3在胁迫48 h时的表达无明显变化外，PdbHMG1～6基因的表达均被镉胁迫明显诱导呈上调表达趋势。而PdbHMG7在所有时间点的表达均呈现下调趋势，在9 h时达到最低水平，为对照的2.70%（图9b）。

2.4.4 ABA 处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式分析

在根中，7 个PdbHMG基因的表达分为3 种明显不同的模式。第1 种，由PdbHMG1和PdbHMG5组成，其表达主要表现为上调，其中，PdbHMG1在所有时间点均被显著诱导，12 h 的表达量达到最高，为对照的176.07 倍。PdbHMG5的表达量在3个胁迫时间点明显升高，在12 h达到最高表达水平（为对照的7.06 倍）。而第2 种表达模式主要是下调表达，如PdbHMG4、PdbHMG6和PdbHMG7的表达大部分时间点呈现显著下调趋势，PdbHMG3的表达在3个胁迫时间点也被明显下调，在48 h时表达量最低，为对照的6.49%。第3种是PdbHMG2基因，其表达在所研究的6个时间点都无显著变化（图10a）。

图10 ABA处理下山新杨PdbHMGs基因表达模式a.根；b.叶Fig.10 Expression analysis of PdbHMGs in response to ABA.a.Roots；b.Leaves

在叶中，PdbHMG2在全部胁迫时间点都被显著诱导，其中24 h 表达量最高（为对照的35.38倍）。而其他基因的表达均与之不同，PdbHMG3、PdbHMG5、PdbHMG6和PdbHMG7在全部胁迫时间点显著下调或无明显变化。PdbHMG1的表达除在24 h 被显著诱导，其他时间的表达无明显变化。PdbHMG4在除胁迫3 h时的表达量明显下调，其他时间的表达呈上调或无明显变化（图10b）。

3 讨论

本研究在山新杨基因组中通过拟南芥同源查找获得了7 条PdbHMGs基因，与拟南芥和白桦HMG 蛋白进化分析结果显示山新杨7条PdbHMGs基因全属于HMGB 亚家族。以往研究发现，HMGB 能够参与转录调控及DNA 合成相关的生物学过程［29］。植物HMGB 蛋白在植物的生命过程中具有至关重要的作用。在正常条件下，玉米ZmHMGB1在烟草（Nicotiana tabacum）中的异位表达能影响烟草幼苗的根部生长发育［30］。将黄瓜HMGB基因转入拟南芥中，会使一部分萌发响应基因的表达受到影响［31］。在拟南芥中，AtHMGB12和AtHMGB15只在种子中表达，说明这两个基因可能在种子的萌发和生长过程中发挥关键作用［8］，山新杨PdbHMG5和PdbHMG3与拟南芥 中AtHMGB12和AtHMGB15的同源性较高，聚在同一分支，因此推测PdbHMG5和PdbHMG3也可能具有相似的功能。AtHMGB13仅在果荚中表达，说明该基因在花分化成果荚的生理过程中具有重要作用［8］，PdbHMG4与AtHMGB13的同源性较高，由此推测PdbHMG4可能也具有相似的功能。与野生型相比，atssrp1/spt16突变体的花青素合成量减少，说明AtSSRP1（AtHMGB7）可能参与了植物花青素的合成过程［32］，而PdbHMG6与AtHMGB7的同源性较高，由此推测PdbHMG6可能也参与了山新杨的花青素合成过程。

此外，植物HMGB 蛋白还参与到植物抵抗逆境胁迫的生理过程中。如在NaCl 胁迫下，白桦BpHMG6茎中的表达量在所有研究时间点均显著上调；进一步研究发现，过表达BpHMG6白桦增强了对活性氧的清除能力和盐胁迫下保护酶的活性，减少了细胞的损伤和死亡，表明BpHMG6可能与白桦的耐盐性有关［15］。对启动子顺式作用元件的分析发现，PdbHMGs各成员均含有与植物激素和逆境胁迫相关的元件，如胁迫响应元件（STRE）、脱落酸响应元件（ABRE）等，由此推测PdbHMGs可能在植物抵御非生物胁迫的过程中发挥作用。在非生物胁迫和激素处理后，对PdbHMGs基因在山新杨根和叶中的表达模式进行了分析。结果显示，PdbHMG1～7均能在至少一个器官中对盐、干旱、重金属以及ABA胁迫处理做出响应。

PdbHMG1在NaCl 和CdCl2胁迫下，在叶中的表达被显著诱导，表明该基因可能在叶应对盐和重金属胁迫中发挥作用。在高盐、干旱、激素和重金属4 种胁迫下，PdbHMG2在叶中的表达被明显诱导，说明该基因可能在叶中参与多种胁迫应答过 程。PdbHMG1、PdbHMG2分 别与AtHMGB1和AtHMGB2的同源性最高。在NaCl 胁迫下，过表达AtHMGB1的拟南芥种子的萌发受到阻碍［33］。盐和干旱处理下，过表达AtHMGB2与野生型相比表现萌发及发育迟缓现象，说明AtHMGB2在胁迫条件下在拟南芥的早期生长发育阶段发挥作用［14，33］。

NaCl、PEG6000、ABA 和CdCl2处理后，PdbHMG7在叶中的表达均呈现下调趋势，表明其也可能参与这4 种胁迫应答。在高盐和ABA 胁迫下，根中PdbHMG6在大部分胁迫时间点的表达显著下调，由此推测其发挥功能的器官可能是根，PdbHMG6可能参与根中ABA 信号途径相关的盐胁迫应答。PdbHMG6基因能否调控ABA依赖的抗逆相关基因的表达仍有待进一步研究。在今后的研究中，可通过转基因的方法对山新杨PdbHMGs基因在非生物胁迫应答过程中发挥的具体功能进行研究与分析。