中药干预上皮间质转化逆转非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药的研究进展

李青青,窦琦璐,薛维伟,王瑞平

(1.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029;2.江苏省中医院,江苏 南京 320106)

肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一。据统计,在男性患者中,肺癌无论是发病率还是病死率均居于癌症中的第一位,而在女性患者中,其发病率和病死率分别居于第三位和第二位,是目前全球癌症死亡的主要原因[1]。其中非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的组织学类型,约占肺癌总数的80%～90%[2]。由于NSCLC发病具有隐匿性,早期无明显症状,大多数患者被确诊时已为晚期肺癌,远期预后欠佳,5年生存率仅为23%[3]。目前,晚期NSCLC的传统一线化疗方案是以铂类为基石的双药方案化疗,但是近10年来,随着靶向治疗研究的不断深入,驱动基因阳性的NSCLC患者在使用靶向药物后,不仅为晚期NSCLC患者带来优于传统化疗的生存获益,也极大改善了晚期NSCLC患者的生活质量。目前表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)已成为表皮生长因子受体(EGFR)基因突变阳性的晚期NSCLC患者的一线治疗方案[4]。但是大多数患者仍面临肿瘤治疗中不可避免的一个问题——耐药性。目前耐药的机制尚未完全明确,近来研究发现EGFR-TKIs耐药与肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)密切相关,而且中药能够通过干预肿瘤细胞EMT以增强EGFR-TKIs敏感性。现将中药干预上逆转EGFR-TKIs耐药的研究进展综述如下,旨在为今后研究提供相关参考。

1 非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药的机制

EGFR基因突变是晚期NSCLC患者中最常见的驱动基因突变,在中国与欧洲,分别约有38.4%和14.1%的NSCLC 患者观察到EGFR突变[5]。其中最常见的 EGFR 突变是外显子 19 缺失和外显子 21 中的 L858R 点突变,他们共同占有临床上高达90% 的EGFR突变[6]。这些EGFR 突变增加了EGFR-TKIs与受体之间的亲和力,从而赋予了EGFR-TKIs对肺癌患者治疗的敏感性。尽管EGFR-TKIs在肺癌治疗中具有良好的治疗效果,能够延长患者的生存周期,提高患者的生活质量,但是大多数患者不可避免地会在治疗1年内发生获得性耐药。目前,EGFR-TKIs耐药相关机制尚不完全明确,研究多集中于以下:靶基因突变、旁路信号通路激活和组织学或表型转化。

1.1靶基因突变 T790M基因突变是第一代和二代EGFR-TKIs中最常见的获得性耐药机制,大约50%～60%接受第一代和第二代EGFR TKIs治疗的患者在进展时携带EGFR T790M突变[7]。T790M基因突变是EGFR 激酶域外显子20中第790位的点突变,这种突变导致“守门人” T790M中苏氨酸的位置被甲硫氨酸取代,进而导致构象变化,引起空间位阻阻碍,降低第一代和第二代EGFR-TKIs的结合活性[8]。此外,这种突变还增加了EGFR对 ATP 的亲和力,使其对ATP的亲和力恢复到更接近野生型EGFR水平,从而降低了三磷酸腺苷(ATP)竞争性EGFR-TKIs的疗效[9]。T790M基因突变是目前唯一被验证的EGFR-TKIs获得性耐药相关基因突变。此外,也有其他二次基因突变(如:T854A、L747S和D761Y等非T790M突变)被报告称会使NSCLC对EGFR-TKIs的治疗敏感性下降,但多为偶发情况报告,并不常见。

1.2旁路信号通路激活 通过激活旁路信号通路使肿瘤细胞生长和存活,其中最常见的旁路途径是MET原癌基因扩增,约占EGFR TKIs获得性耐药的病例的5%[10]。间质上皮转化因子(MET/c-Met)原癌基因扩增会激活ErbB3(EGFR 家族的成员)的磷酸化及下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路异常活化,在 EGFR-TKIs存在的前提下,“绕开” EGFR-TKIs提供旁路通路,从而导致 EGFR-TKIs耐药[6]。此外BRAF突变、PIK3CA突变、KRAS突变、HER2扩增,PTEN丢失、NF-1丢失和CRKL扩增等也可造成EGFR-TKIS的获得性耐药。

1.3组织学或表型转化 小部分患者在对EGFR-TKIs耐药后,发生了EGFR突变型腺癌转化为小细胞肺癌(SCLC)的组织学转化[11],这些转化的肿瘤显示出类似于经典小细胞肺癌的分子特征,例如视网膜母细胞瘤蛋白(RB)活性和肿瘤抑制蛋白(TP53)活性的丧失。虽然肿瘤在完成转化后仍保留了最初的EGFR突变,但EGFR表达急剧降低,表明这些肿瘤不再受EGFR信号驱动[12]。肿瘤细胞EMT的不当诱导导致肿瘤侵袭、转移、耐药性和干细胞特性。研究表明,细胞EMT中上皮细胞通过失去细胞极性和细胞间黏附,获得侵袭和迁移特性而转化为间充质干细胞,伴随着抗凋亡信号的上调和分子标记蛋白表达的变化,即下调E-钙黏蛋白的表达,上调波形蛋白、纤连蛋白和N-钙黏蛋白的表达,导致对EGFR TKIs的获得性耐药[13]。同时也有相关报道称,包括AXL、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TGF)-β、PDGFR、MED12、Notch-1和ZEB1内的几种途径和分子的激活与具有EMT特征的细胞中EGFR-TKIs耐药性有关[14]。此外,也有研究发现细胞在微小RNA-200c(miR-200c)调控下能够激活EMT通路,进而导致EGFR-TKIs的耐药性[15]。

2 EMT在非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药中的作用

EMT是上皮细胞转化为间质细胞的一个复杂的细胞过程,在上皮间质转化过程中,细胞失去其上皮特征、顶基极性、细胞间黏附复合物和上皮组织特异性的细胞骨架结构。同时,细胞获得间质类型的细胞极性、单独迁移的能力和侵袭能力[16]。EMT过程中随着细胞间黏附蛋白和紧密连接丧失,导致上皮细胞之间彼此分离。同时,EMT过程中增强间质细胞标记物(如波形蛋白)的表达,并促进与细胞外基质(ECM)的附着和获得间质细胞特征,如纺锤形细胞形态和肌动蛋白应激纤维的重组,从而获得单独迁移和侵入基底膜、血液和淋巴管壁的能力[17-18]。在大部分恶性上皮肿瘤如乳腺癌、肺癌中均可发现EMT的现象,且EMT的发生与肿瘤的浸润、转移及耐药性密切相关。

Sequist等[19]对37例EGF-TKIs耐药后NSCLC患者的肿瘤活检进行了系统组织学分析后发现,其中有2例患者的活检标本发现了EMT,且未发现其他耐药机制。无独有偶,Poh等[13]在临床中对1例阿法替尼耐药后患者的肿瘤标本进行检测,未发现除了EMT以外的其他已知的获得性耐药机制。这表明EMT在EGF-TKIs耐药过程中发挥着独特的重要作用。Lee等[20]发现吉非替尼耐药细胞株中E-钙黏蛋白表达水平显著下调,N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平上调,表明吉非替尼耐药细胞株发生EMT。同时通过分析更多上皮标志物(包括 CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3)以及间质标志(Snail、Slug、Twist1、Twist2、ZEB1、ZEB2和纤连蛋白的mRNA)水平后,进一步证实了吉非替尼耐药细胞株中EMT的发生。同时在后续的实验中发现,长期停用吉非替尼后,随着EMT的逆转,肺癌细胞对吉非替尼的敏感性也在不断恢复。此外,Weng等[21]报道,具有吉非替尼或奥希替尼获得性耐药的NSCLC细胞表现出E-钙粘蛋白减少,波形蛋白和干细胞特性增加的EMT特征,且没有任何EGFR二次突变,并能够通过逆转EMT恢复吉非替尼和奥希替尼的敏感性。这些都说明EMT在肺癌EGFR-TKIs耐药中担任了重要的角色,同时逆转EMT可以恢复TKIs的敏感性。

3 中药从EMT途径逆转EGFR-TKIs耐药的研究进展

中医药治疗肿瘤具有多途径、多靶点的特点,基于肿瘤微环境多信号通路研究中医药复方干预EMT逆转肺癌靶向治疗耐药,符合传统医学的整体观念。

3.1中药单体 Cheng等[22]研究发现,榄香烯与吉非替尼联合作用于耐TKI肺腺癌A549和H1299细胞时,可显著提高上皮标志物 E-钙粘蛋白的表达水平,同时抑制间质标志物ZEB1、Snail 和 Twist及波形蛋白的表达,抑制癌细胞增殖、存活、侵袭和迁移,与吉非替尼单药治疗相比,两者联合治疗能够有效地干预EMT逆转肺癌TKI治疗耐药。沈云飞等[23]通过观察耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞凋亡、增殖及侵袭能力和EMT相关蛋白表达情况,来探讨苦参对PC9/ZD细胞EMT及吉非替尼药物敏感性的影响,研究发现与对照组(不加药物)及吉非替尼组相比,苦参联合吉非替尼实验组细胞中N-钙黏蛋白及波形蛋白的表达被不同程度抑制,E-钙黏蛋白的表达被上调,同时在苦参联合吉非替尼组中PC9/ZD细胞侵袭率远低于对照组及吉非替尼组,凋亡率与腺癌细胞增殖抑制率远高于对照组及吉非替尼组。提示中药苦参可能通过调控EMT这一过程实现逆转吉非替尼的耐药性。魏佳等[24]探究黄芪多糖逆转吉非替尼获得性耐药肺腺癌细胞的作用,实验中将吉非替尼单药作用于对PC9/EMT细胞48 h后,通过CCK8实验检测其对肿瘤细胞增殖抑制率为40.4%,而黄芪多糖与吉非替尼两药共同作用于细胞48 h后,检测其对肿瘤细胞增殖抑制率为51.0%。且两药联用与单药相比较后,发现两药联用中的细胞上皮标志E-钙黏附分子的蛋白和mRNA表达量明显上升,作为细胞间质标志物波形蛋白的蛋白和mRNA表达量明显下降。说明,黄芪多糖可通过抑制EMT来提高吉非替尼耐药的敏感性。陈灏等[25]通过Western blot实验探讨姜黄素干预耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞EMT过程的作用机制,实验研究发现与亲代耐药细胞相比,经姜黄素处理后,耐吉非替尼肺腺癌细胞株的中P-AKT和P-MTOR呈现低表达状态,波形蛋白表达下调、E-钙黏附分子表达上调,由此可见,姜黄素通过阻断P13K/AKT/mTOR信号通路及增强上皮标志蛋白表达,抑制间质标志蛋白表达,以改变耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮间质化过程。吕昕等[26]以转化生长因子-β(TGF-β1)诱导发生EMT肺腺癌H358细胞为研究对象,分别给予花蛇舌草乙醇提取物(EEHD)、吉非替尼及两药联用后观察48 h,观察各组细胞株中细胞生长抑制率、凋亡率,E-钙黏蛋白、EGFR、波形蛋白蛋白表达率,实验发现各组均可不同程度上抑制H358细胞增殖,上调E-钙黏蛋白表达水平,下调波形蛋白、EGFR蛋白表达水平,且两药联合使用组的细胞生长抑制率、凋亡率及E-cadherin蛋白表达率显著高于吉非替尼单药组,而波形蛋白、EGFR蛋白表达率显著低于吉非替尼单药组。研究表明[26],EEHD可部分干预肺腺癌H358细胞EMT和肿瘤细胞的增殖,EEHD与吉非替尼两者联用具有协同增效作用,进而减少肺腺癌EMT所致吉非替尼耐药的发生。

3.2中药复方 罗杨等[27]从EMT角度出发,通过检测肺腺癌H1975荷瘤小鼠移植瘤twist、fibronectin表达情况,探讨除痰解毒方(广木香、砂仁、党参、白术、茯苓、姜半夏、厚朴、陈皮、浙贝母、薏苡仁、红豆杉、三棱、莪术、威灵仙、仙鹤草、鱼腥草和金荞麦)逆转肺癌吉非替尼耐药机制,实验中将建好的裸鼠模型随机分为模型组,吉非替尼组,除痰解毒方高、中、低剂量组,吉非替尼联合除痰解毒方中剂量组,治疗并观察2周后发现,除痰解毒方及联合用药组可不同程度地下调EMT相关蛋白twist和fibronectin及mRNA的表达,因此可以分析得出,除痰解毒方逆转肺癌靶向药物耐药的机制可能与调控EMT相关蛋白twist和fibronectin的表达水平有关。李龙妹[28]使用扶正抗癌方(黄芪、太子参、白术、甘草、炒薏苡仁、山慈姑、白花蛇舌草、龙葵、石见穿、八月札、莪术)分别予以吉非替尼原发性耐A549细胞株和继发性耐药H1650细胞浓度为0,1,1.5,2 mg/mL的扶正抗癌方中药煎剂处理,实验研究发现随着中药浓度的增大,MET相关性蛋白N-钙黏蛋白及波形蛋白表达水平随之下调,从而提高H1650、A549 细胞对吉非替尼的敏感度,抑制其耐药性。曾建昌等[29]观察复方苦参注射液(苦参、白土苓)联合奥希替尼干预后细胞活力、细胞侵袭能力、细胞凋亡状况、P13K/AKT/mToR信号通路相关因子及EMT相关因子的表达,发现复方苦参注射液能够抑制肿瘤细胞侵袭、增殖和EMT,促进肿瘤细胞凋亡,而且这一作用机制可能与P13K/AKT/mTOR激活具有相关性。

4 问题与展望

近些年来,肺癌EGFR-TKIs治疗以其优于化疗的疗效性,低于化疗的毒副反应,而越来越被人们所关注,广泛的应用于临床治疗中。但是,EGFR-TKIs的获得性耐药是人们不得不面对的一个问题,而目前耐药机制的研究主要集中在T790M突变、KRAS突变、c-Met原癌基因扩增等方面。但随着近些年对耐药机制研究的不断深入,人们发现肿瘤细胞的EMT与EGFR-TKIs获得性耐药之间有着千丝万缕的关系,而EMT的可逆转性也让我们看到了逆转EGFR-TKIs耐药的可能性。但是EMT介导EGFR-TKIs耐药的作用机制呈现复杂且多样性,目前尚未完全明确,仍有待进一步深入研究和探索。

多项研究表明,中药与肺癌EGFR-TKIs联合使用能够抑制肿瘤细胞侵袭、增殖及EMT的发生,加快肿瘤细胞的凋亡,同时中药与EGFR-TKIs联合使用还具有协同增效的作用。但是也不可避免地存在一些问题,目前研究多为体外实验研究,缺乏体内实验研究及前瞻性、多中心、大样本的临床研究数据,且中药研究多为中药单体研究,其具体作用机制及作用靶点现在尚不得而知,中药复方研究较少,且无统一治疗标准,无法形成规范化治疗标准。这些问题有待今后进一步研究探索。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。