高效液相色谱法测定冷面、米线中乙二胺四乙酸二钠

丁梅

（梅河口市食品药品检验检测中心，吉林梅河口 135000）

目前真空包装的冷面、米线等加工食品因食用方便、特色美味而深受广大消费者的青睐，逐渐成为人们尤其是年轻人的主食之一。因为冷面、米线水分含量大且营养丰富，非常适合微生物生长繁殖，容易引起发霉变质，影响保质期，所以冷面、米线保质期短是阻碍其产业发展的最大瓶颈。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定，乙二胺四乙酸二钠食品添加剂可作为稳定剂、凝固剂、抗氧化剂、防腐剂，在果酱、果脯、腌渍的蔬菜、坚果与籽类罐头、杂粮罐头、复合调味料、饮料等食品中限量使用，但不允许在面粉制品和大米制品中使用[1]。然而，乙二胺四乙酸二钠因具有良好的抗氧化和防腐作用，可有效延缓酶触褐变，延长保质期，经常被部分不法商贩超范围使用在面粉及其制品中，以提高产品的感官品质[2-6]，因此，以小麦粉、大米粉为原料加工的冷面和米线存在较大的安全风险，需建立冷面、米线中乙二胺四乙酸二钠的测定方法，以便对其进行风险监控和评估。

乙二胺四乙酸二钠的测定方法主要有液相色谱法[2-10]和液相色谱-串联质谱法[11-13]，目前研究方向主要是针对番茄酱、腌渍蔬菜、各种罐头等食品以及药用注射液中乙二胺四乙酸二钠的测定。国家标准GB 5009.278—2016[14]和 行 业 标 准SN/T 3855—2014[15]的适用范围也不包括于冷面和米线样品测定。采用高效液相色谱法测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的含量虽然有文献[2-6]报道，但其多采用三氯甲烷净化或用阴离子(PXA)固相萃取柱净化，前处理过程复杂。笔者根据冷面、米线样品中含有大量淀粉，但其不含或少含色素和油脂的基质特性，在国家标准方法和文献[4,6]的基础上，采用高速冷冻离心的净化方式，建立了冷面、米线中乙二胺四乙酸二钠的高效液相色谱测定方法。该方法操作简单快速，回收率、重复性均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求[16]，为冷面、米线中乙二胺四乙酸二钠的检测提供了技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

涡旋混合器：300～3 500 r/min，重载数显型，上海安谱科学仪器有限公司。

超声波清洗器：KQ-500DE型，江苏昆山市超声仪器有限公司。

高速冷冻离心机：KH20R-Ⅱ型，湖南凯达科学仪器有限公司。

甲醇：色谱纯，美国飞世尔科学世界公司。

四丁基溴化铵、乙酸钠：优级纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

磷酸、盐酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

三氯化铁：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

乙二胺四乙酸二钠标准物质：纯度(质量分数)为99.96%，标物编号为GBW(E) 060025，坛墨质检科技股份有限公司。

若记439nm、445nm、460nm…2209nm这45个指标的值分别为X1、X2、X3… X45,两个主成分PC1、PC2的得分记为y1、y2,综合得分记作y综。利用表达式y=ZX×t,得到两个主成分各自的得分y1、y2,再将这两个主成分的得分值以各自对应特征值的方差贡献率求和,既得到主成分的综合得分,即

微孔滤膜： wwPTFE 膜，孔径为0.2 µm，φ13 mm，美国颇尔公司。

冷面、米线样品：市售。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Shimpack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本岛津制作所)；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；流动相：四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液(pH 4.0)-甲醇(85∶15，体积比，下同)，流量为1.0 mL/min。

1.3 溶液配制

四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液：称取6.45 g四丁基溴化铵、2.46 g 乙酸钠，加入1 000 mL 水，超声溶解，加入磷酸调节pH 至4.0±0.1，经0.22 μm 水相滤膜过滤后备用。

三氯化铁溶液：称取0.54 g 三氯化铁，溶于90 mL 水中，加入0.10 mL 盐酸，转移至100 mL 容量瓶中，用水定容至标线，混匀。

乙二胺四乙酸二钠标准溶液：1 mg/mL，准确称取乙二胺四乙酸二钠标准品10 mg，用水溶解并定容至10 mL。

乙二胺四乙酸二钠系列标准工作溶液：准确吸取乙二胺四乙酸二钠标准溶液25、100、250、500、2 500 μL 于50 mL 比色管中，加入水25 mL、三氯化铁溶液1.0 mL，涡旋混匀1 min，超声20 min，加水定容至标线，配制成乙二胺四乙酸二钠的质量浓度分别为0.5、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

称取冷面或米线样品5.0 g 于50 mL 具塞离心管中，加入25 mL 水，涡旋1 min，超声20 min，于4 ℃下以9 500 r/min转速离心5 min，取上清液于50 mL 比色管中。剩余残渣重复提取一次，离心后合并上清液，加水定容至50 mL。吸取5 mL上清液于15 mL离心管中，加入0.5 mL三氯化铁溶液，涡旋混匀1 min，超声20 min，于4 ℃下以9 500 r/min 转速离心5 min，取上清液过0.22 μm 滤膜，作为样品溶液。

1.5 样品测定

将乙二胺四乙酸二钠系列标准工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。将样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，根据标准工作曲线得到待测样品溶液中乙二胺四乙酸二钠的质量浓度，再根据样品的稀释倍数，计算样品中乙二胺四乙酸二钠的含量，以质量分数表示。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱与流动相选择

乙二胺四乙酸二钠是极性很强的化合物，在普通C18色谱柱上基本无保留，若选择使用普通C18色谱柱，必须使用含离子对试剂的流动相进行洗脱，以增加乙二胺四乙酸二钠在C18色谱柱上的保留时间；或者选择使用SAX强阴离子交换色谱柱，以含磷酸二氢钾缓冲液的流动相洗脱。由于C18色谱柱的普及性和通用性均较好，同时考虑到配制离子对试剂流动相和配制磷酸盐缓冲液流动相的难易程度相当，所以选择以Shimpack VP-ODS C18色谱柱分离。参考国家标准方法GB 5009.278—2016，以四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液-甲醇(体积比为85∶15)为流动相等度洗脱，乙二胺四乙酸二钠色谱保留时间、色谱峰形、响应值均满足检测要求。乙二胺四乙酸二钠标准溶液的色谱图如图1所示。

2.2 样品处理方法优化

GB 5009.278—2016 方法的适用检测对象不包括冷面和米线样品，若以该标准方法处理冷面和米线样品，采用过混合阴离子(PXA)固相萃取柱净化，很容易发生固相萃取柱堵塞。另外经实验证实，采用过固相萃取柱的净化方式，冷面、米线加标样品(加标量为100 mg/kg)的回收率均小于20%。其主要原因是冷面、米线样品中含大量淀粉基质，在堵塞萃取小柱的同时，阻碍乙二胺四乙酸二钠的洗脱，即用国标方法规定的5%甲酸-甲醇水溶液5 mL 无法完全将乙二胺四乙酸二钠洗脱下来，从而造成回收率偏低。根据冷面和米线样品中不含或少含色素和油脂的基质特性，样品经水提取，再用三氯化铁络合，采用在4 ℃下以9 500 r/min转速离心5 min的净化方式，能有效去除样品基质干扰。采用该处理方法分别对冷面、米线加标样品(加标量100 mg/kg)进行测定，加标回收率均在90%以上，满足检测要求。空白冷面、加标冷面样品色谱图分别如图2、图3所示。

图3 加标冷面色谱图

2.3 线性方程与检出限

在1.2仪器工作条件下，分别对乙二胺四乙酸二钠系列标准工作溶液进行测定，以乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。乙二胺四乙酸二钠的质量浓度在0.5～50 µg/mL 范围内与色谱峰面积有良好的线性关系，线性方程为y=33 620.783 29x-19 773.734 48，相关系数为0.999 8。

在空白冷面和空白米线中加入低浓度的乙二胺四乙酸二钠标准溶液，按1.2仪器工作条件测定并计算信噪比，分别以3倍、10倍信噪比对应的样品中乙二胺四乙酸二钠的质量分数为方法检出限、定量限，得冷面、米线样品中乙二胺四乙酸二钠检出限均为1.5 mg/kg，定量限均为5 mg/kg。

2.4 加标回收与精密度试验

按三个浓度水平在空白冷面、米线样品中加入乙二胺四乙酸二钠标准溶液，按1.4方法制备成加标样品溶液，进行样品回收试验。对每个添加水平平行测定6 次，结果见表1。由表1 可知，乙二胺四乙酸二钠的加标回收率为90.7%～103.5%，测定结果的相对标准偏差为1.2%～5.0% (n=6)，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》对精密度、回收率的要求。

表1 冷面、米线样品加标回收试验结果

3 结语

国家标准方法GB 5009.278—2016 适用于果酱、果脯、腌渍的蔬菜罐头、蔬菜泥(酱)、坚果与籽类罐头、八宝粥罐头、复合调味料、饮料等基质样品中乙二胺四乙酸二钠的测定，在国标方法的基础上，优化了样品处理方法，建立了适合冷面、米线基质样品的乙二胺四乙酸二钠分析方法，是国标方法的有力补充。该方法操作简单、快速，准确度、重现性好，为冷面、米线中乙二胺四乙酸二钠的测定提供了方法依据和技术支持。